Traffico macromolecolari tra le cellule delle piante può essere valutata transitoriamente esprimere una proteina fluorescente-tagged di interesse e per analizzarne la distribuzione intra-ed intercellulare mediante microscopia confocale.
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Articolo metodologico
Una cellula-cellula Macromolecole saggio di trasporto In Planta Utilizzando Bombardamento Biolistic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, vi presentiamo un protocollo semplice e rapido per rilevare e valutare l'entità del cellula-cellula trasporto macromolecolari in planta. In questo protocollo, una fluorescente con tag proteina di interesse è transitoriamente espressa in tessuti vegetali dopo la consegna biolistic del suo DNA codifica costruire. La distribuzione intra-ed intercellulare della proteina tag viene quindi analizzato al microscopio confocale. Descriviamo questa tecnologia nel dettaglio, fornendo passo-passo protocolli di saggiare e valutare l'entità del trasporto delle proteine symplastic in tre specie di piante, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e N. tabacum (tabacco).
Protocollo
Fondo
Symplastic trasporto di macromolecole attraverso connessioni impianto intercellulari, il plasmodesmi, è di interesse per molti patologi vegetali e biologi. Per esempio, diverse proteine virali sono noti per regolare plasmodesmal limiti di esclusione dimensioni per permettere il movimento virale 1-3. Inoltre, alcune proteine endogene, tra i quali importanti regolatori dello sviluppo, si presume per passare da una cella all'altra, presumibilmente attraverso plasmodesmi, per funzionare non-cell-autonomo 4. Così, una metodologia affidabile per identificare e visualizzare il trasporto macromolecolare tra cellule v....
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Discussione
La chiave per il successo del saggio di trasporto symplastic è quello di ottenere elevata efficienza di trasformazione, che consente la produzione di cluster segnale statisticamente significativi e facilmente misurabili. Ciò può essere ottenuto utilizzando le foglie raccolte da piante sane, robuste, e la preparazione di particelle di oro rivestite da una preparazione del DNA puro e concentrato.
Utilizzando le foglie in fase di crescita stessa è fondamentale anche per l'affidabilità del t.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il nostro lavoro è supportato anche da finanziamenti NIH / NIGMS, NSF, USDA / NIFA e BARD a VC.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microsferette d'oro, diametro di 1,0 μm | Bio-Rad | 165-2262 | |
| Microsferette d'oro, diametro di 0,6 μm | Bio-Rad | 165-2263 | |
| Spermidina | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Tubo in Tefzel | Bio-Rad | 165-2441 | |
| Stazione preparatoria per cartucce Helios | Bio-Rad | 165-2420 | |
| Taglierina per tubi | Bio-Rad | 165-2422 | |
| Pistola genica Helios | Bio-Rad | 165-2432 | |
| Regolatore di gas elio | Bio-Rad | 165-2413 |
Riferimenti
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lucas, W. J. Plant viral movement proteins: agents for cell....
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Ristampe e permessi
