Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse
Summary
Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.
Abstract
Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen<em> In vivo</em>. Mit Escherichia coli als Modellsystem, beschreiben wir ein Verfahren, bei dem zwei-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die strukturellen Zwischenprodukte, die auf replizierende Plasmide entstehen identifiziert werden können<em> In vivo</em> Folgende UV-induzierten DNA-Schäden. Dieses Verfahren wurde verwendet, um nachzuweisen, dass Replikationsgabeln durch UV-induzierte Schäden blockiert eine vorübergehende Umkehr, die von RecA und mehrere Genprodukte mit dem RecF Weg verbundenen stabilisiert zu unterziehen. Die Technik zeigt, dass diese Replikation Zwischenprodukte bis zu einer Zeit, die mit der Entfernung der Läsionen, die durch Nukleotidexzisionsreparatur Reparatur und Replikation fortgesetzt korreliert werden beibehalten.
Protocol
Discussion
Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit in unserem Labor wird von CAREER-Preis MCB0551798 von der National Science Foundation und AREA gewähren R15GM86839 aus dem NIGMS-NIH unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
Riferimenti
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