在完整的果蝇幼虫体内的亚细胞分辨率成像

Summary

本协议描述了一种可靠的方法，麻醉和完整的成像<em>果蝇</em>幼虫。我们利用挥发性麻醉药氟烷允许重复成像，在亚细胞的分辨率和结构的重新鉴定几天¹。

Abstract

在光学成像，基因编码的荧光基团和遗传工具最近已经启用了改进，使所需的转基因动物线的建立有效的生物过程的研究，并在生活中甚至在某些情况下的行为，有机体。在这个协议中，我们将描述如何麻醉完整的果蝇幼虫，使用挥发性麻醉剂氟烷，跟随在亚^细胞决议1-3突触人口的发展和可塑性。虽然其他有用的方法来麻醉果蝇幼虫以前曾描述^4,5,6,7,8，本文介绍的协议表明由于以下组合键功能显着改善：（1）麻醉的程度非常高，甚至在被逮捕的心脏跳动允许横向分辨率可达150纳米^1，（2）> 90％，每麻醉周期的成活率高，允许在一个小时内的五年多时间点^的记录天2（ 3）高灵敏度，使我们在2个实例研究的动态表达的蛋白质在生理水平。在细节上，我们能够以可视化的突触后的谷氨酸受体亚基GluR – IIA表示，通过在稳定的转基因株系的内^源性启动子1和外显子陷阱行^FasII – GFP 1。 （4）与其他方法相比^4,7幼虫可成像不仅活着，而且还完整无缺（即非解剖）观察到发生在若干天^1。影随行的细节功能的各个部分在体内成像室^2,3，幼虫，麻醉过程，如何重新确定在幼虫的具体岗位和幼虫安全拆除的正确安装，从成像会议厅。

Protocol

一）大会的成像室选择的选择阶段的幼虫（如早期的第三龄幼虫离开约24小时的观测时间间隔在25 °，直到徘徊阶段彗星）。 幼虫用清水冲洗干净的培养基中，民建联干。 大衣中心室底部的元素，该地区面临的幼虫，用的卤烃油的薄膜。 忍受的腹侧方在会议厅内的显微镜物镜面临的幼虫（使神经肌肉接头（NMJ）26日和27日进行成像）（图1 AE）。 广场上一层油的塑料垫片，电网朝上（图1）通风槽。请确认在这一步：间隔的高度大约有一半的幼虫直径，缝隙宽度应幼虫直径的两倍左右。 放置在显微镜的成像室二）幼虫麻醉用适当的麻醉设备/蒸发器，连接香港总商会的两个进气口。 请验证的前端： 有效地氟醚在房间内的空气浓度不应超过安全法规规定的！只有一个很小的地氟醚的总量是需要麻醉的幼虫。地氟醚1（V / V）15％的应用程序已被证明是一个很好的出发点，确定要在实验中使用的理想浓度。出于安全原因，我们建议，蒸发器，不应该包含更多地氟醚，比需要2-4小时 ，在体内成像。 浸入一杯水室出口管的另一端，然后打开阀门控制流室约五秒钟的麻醉。 请确认在这一步： 气泡在水中升天？如果没有商会是漏水。 关闭阀门，约三秒钟。 在显微镜的监视残余幼虫运​​动。检查的心跳和肌肉的运动。如果有必要打开和关闭阀门，在步骤8和9所述，直到完成幼虫麻醉，然后关闭所有阀门，并开始成像。 请确认在这一步： 剩余的肌肉运动或心跳表明幼虫是不正确麻醉的。完整的麻醉是至关重要的高分辨率图像。幼虫一般应不长于15-20分钟，麻醉在一个给定的的时间。 三）成像确定正确的地位和形象的利益格局（图2-4）。 四）从麻醉恢复成像完成后，让空气进入墓室。 请确认在这一步： 检查发送的卤素灯幼虫的心跳和肌肉收缩。当肌肉开始收缩，它是安全的删除从成像室的幼虫。 从麻醉设备分离室，从显微镜中取出。仔细拆解的商会，并放置在泥飞栽培介质的幼虫。 存放在适当的温度在孵化器的菜。 五）时间序列重复步骤2-14，直到已获得足够的时间点。 替代协议： 如果30分钟的时间间隔内超过一次成像幼虫，它可能是实际离开它，直到下一次麻醉时间点在成像室。重复步骤7-14，直到已获得足够的时间点。 请确认在这一步： 幼虫不保存时间超过两小时的影像室，也不是它是麻醉时间长于15-20分钟。 图1成像室大会 。 （a）将上一层油的幼虫和塑料垫片。 （b）将垫片上一个22 × 22毫米盖玻片和插入室有机玻璃导环，未来（三）修复的金属环的幼虫位置，和（D）关闭室。 （e）现在是随时可以安装在显微镜室。 图2在果蝇幼虫体壁肌肉 。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP – SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时成幼虫通过角质层腹侧的肌肉显示。在最浅肌层，27，（AC）显示，在（吉隆坡）最内部的肌肉，第6和7，显示的。比例尺：100微米，片之间的ΔZ是2微米。 图3在果蝇幼虫体壁肌肉的身份。表明身份，是A3，段L3 果蝇幼虫的肌肉。肌肉和NMJs一个CD8 + GFP – SH表达融合蛋白8的可视化。作为观察对焦时通过角质层腹侧到幼虫的肌肉显示。最浅肌层，27岁，在AC显示，在吉隆坡的最内部的肌肉，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片是2微米。 图4 果蝇幼虫神经肌肉接头的身份。 （AD）NMJs的一个DGluRIIA MRFP融合蛋白 1表达的可视化。 NMJs是作为观察重点是通过角质层腹侧成幼虫。在（AB），最肤浅的NMJ，27岁，是所示，在CD最内部的NMJs，6日和7所示。比例尺：100微米，ΔZ之间切片为5μm。 （E）和（F）的肤浅的（E）和更大的内部（F）的NMJs的身份，以供参考。

Discussion

最初，该方法的开发研究谷氨酸对果蝇幼虫的体壁肌肉的突触。 果蝇神经肌肉接头（NMJ）的特点是一个定型的肌肉和神经细胞的细胞质架构，因而非常适合在体内成像。然而，描述的麻醉协议是不仅限于成像NMJ果蝇幼虫的透明度，有利于适应所描述的协议的研究器官发育，细胞迁移，细胞内的亚细胞的轴突货物和重组运输。

Materials

Reagents:

• Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
• Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
• Fly culture medium

Equipment:

• Inverted confocal microscope
• Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
• Small paintbrush as used to sort flies
• Incubator
• Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
• Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)