Summary
Questo video dimostra un approccio controllato ambiente per studiare la degradazione dei tessuti vegetali lignocellulosici da funghi aerobico. La capacità di controllare le fonti di nutrienti e l'umidità è un vantaggio chiave di agar-block microcosmi, ma l'approccio produce spesso alterne fortune. Ci rivolgiamo insidie critici cedere riproducibile, a bassa variabilità dei risultati.
Abstract
I due metodi principali per lo studio biodegradazione fungine dei tessuti vegetali lignocellulosiche sono stati sviluppati per i test del legno (suolo-block; agar-block). E 'ben accettato che il suolo-block microcosmi rendimenti più elevati tassi di decadimento, meno problemi di umidità, bassa variabilità tra gli studi, e soglie più elevate di tossicità conservante. Suolo-block test è quindi la tecnica più utilizzata ed è stato standardizzato dalla American Society for Testing and Materials (ASTM) (metodo D 1413-07). Il terreno blocco design è inconvenienti, però, utilizzando fonti suolo localmente variabile e nel limitare il controllo delle sostanze nutritive esterna (esogena) ai tessuti in decomposizione. Questi svantaggi sono emersi come un problema per l'applicazione di questo metodo per gli altri, ha come obiettivo la ricerca sempre più popolare. Questi obiettivi includono moderni legnocellulosa degradante per la ricerca per la bioenergia, il collaudo biorisanamento di co-metabolizzata sostanze tossiche, valutando i meccanismi ossidativi e il monitoraggio elementi traslocato lungo le reti ifale. Suolo blocchi non prestano abbastanza controllo in queste applicazioni. Un raffinato agar-block approccio è necessario.
Qui usiamo il marciume bruno legno degradanti fungo lacrymans Serpula a degradare legno in agar-blocco microcosmi, con profondo Petri con basso contenuto di calcio agar. Testiamo il ruolo di esogeni gesso su decadimento in una serie temporale, per dimostrare l'utilità e la variabilità attesa. Isolati da una singola scheda rip (taglio longitudinale) sono condizionati, pesato, in autoclave, e introdotto in modo asettico in cima a una rete di plastica. Vaccinazioni fungine sono in ogni faccia del blocco, con esogena gesso aggiunti alle interfacce. Raccolti sono asettiche fino al raccolto finale distruttivo. Questi microcosmi sono progettati per evitare il contatto blocco con agar o pareti piastra di Petri. Condensa è ridotto al minimo durante piatto versa e durante l'incubazione. Infine, l'inoculo / gesso / legno spazio è ridotto al minimo, ma senza permettere contatto. Questi aspetti meno tecnici di agar-block design sono anche le cause più comuni di fallimento e la principale fonte di variabilità tra gli studi. Pubblicazione del video è quindi utile in questo caso, e dimostriamo a bassa variabilità, risultati di alta qualità.
Protocol
Questo protocollo si applica a substrati legnosi e non legnosi, come indicato, oltre al materiale forno o aria secca. Leggere il primo protocollo, tuttavia, prima di set-up. Ci sono diversi punti sollevati che potrebbero valere per il vostro studio, e questi punti (sottolineato) richiedono una pianificazione. Si noti inoltre che ci sono due pubblicati agar-block metodi che sono a volte utilizzati, uno dei British Standard 838 e un altro a seguito di un gruppo di ricerca internazionale per la protezione del legno (IRG-WP) documento presentato da Bravery (1978). Il nostro metodo assomiglia a 838, con modifiche soprattutto nella progettazione microcosmo e il controllo del mezzo agar, ma ancora una volta, entrambi gli approcci sono spesso evitate a causa di problemi storici controllo dell'umidità in blocchi di legno, causando anossia e variabilità. Una buona recensione di questi metodi di prova che comprende la discussione di agar-block disegni, tra cui lo standard 838, può essere trovato in Nicola (1973).
1) Preparazione Microcosmi
Microcosmi per questi studi sono 1 cm piu 'alto (più profonda) rispetto ai tipici piatti di Petri, aumentando lo spazio sopra la testa blocchi di legno. Sono pieni di una modesta quantità esatta di agar e per il controllo assoluto quantità di nutrienti, in aggiunta alla loro concentrazione, e per mantenere blocchi di legno ben lontano (> 3 mm) dal coperchio. L'agar utilizzato in questo caso di test gesso è un basso contenuto di calcio, tipo A agar, tuttavia, ci mostrano risultati rappresentativi utilizzando medium Blakeslee, il medium ATCC raccomandato per il mantenimento della prova isolato di lacrymans Serpula (Wulfen: Fries) Schroeter ceppo EMPA 65 ( ATCC 32750).
Questo progetto tiene tessuti vegetali lontano dal contatto agar e lontano dal coperchio piatto e pareti. Bagnatura variabile di substrati lignocellulosici è la principale fonte di variabilità in agar-block test. Bagnatura per aumentare il contenuto di umidità crea anossia e sopprime o addirittura ferma biodegradazione aerobica. Si crea anche un problema per chi studia i meccanismi ossidativi di funghi marciume bruno e nero responsabile per la decomposizione del legno. Condensa sul coperchio piatto è un problema se in forma libera gocce d'acqua e bagnare il substrato. Allo stesso modo, legno e altri tessuti si 'stoppino' acqua rapidamente da agar-agar a contatto, portando a contenuto di umidità superiore al 80% (in peso secco. Base) e arrestare il degrado aerobica. I tessuti devono essere distanziati da queste fonti d'acqua, permettendo al fungo filamentoso di cercare, collegarsi, e di controllo dell'umidità all'interno del substrato.
- Agar fare abbastanza per riempire il numero desiderato di piastre di Petri con 20 ml di agar-agar, ciascuno. Noi usiamo cinque repliche (n = 5) per trattamento, determinato mediante l'analisi di potenza utilizzando i risultati precedenti.
- Per il calcio e ferro-priva di tipo A agar, si aggiungono 15 g di agar per un pallone da 500 ml contenente circa 400 ml di acqua deionizzata modificata con 1,0 g di NH 4 NO 3, 1,0 g monobasico KH 2 PO 4, 0,25 g MgSO 4 x 7H 2 O, e 1,0 g di glucosio. Alla miscela, usiamo soluzioni madri per aggiungere micronutrienti. Noi aggiungere 50 microlitri di ogni H 3 BO 4 (0,057 g / 100 ml) e ZnSO 4 (0.031 g / 100 ml). Noi aggiungere 50 microlitri di ciascun MnCl 2 (0,036 g / 100 ml), CuSO 4 (0.039 g / 100 ml), e (NH 4) 6 Mo 7 O 24 (0,018 g / 100 ml). Una volta che i nutrienti sono aggiunti, riempire il matraccio alla linea da 500 ml.
- Un'aggiunta di calcio tipico in questo caso sarebbe 0,05 g CaCl 2 x 2H 2 O / 500 ml. Nel nostro caso, utilizzare il calcio agar come trattamento, con una concentrazione 5 mM finale. Noi contrastare l'aumento della forza ionica oltre e cloruro con l'aggiunta di 5 mM NaCl agli altri microcosmi. Allo stesso modo, usiamo ferro multimediale gratuito per questa dimostrazione, ma nei casi in cui è incluso il ferro, abbiamo mix di 0,112 g di FeSO 4 con 2 ml di acqua deionizzata e aggiungere 50 ml di questa soluzione fresca (non stock) immediatamente dopo vortex. In ogni supporto in cui è possibile controllare le aggiunte di nutrienti, è saggio per testare il pH prima autoclave. Integrazioni acida o basica (es. FeCl 3) influenzerà la solidificazione.
- Trasferire file multimediali ad un pallone e autoclave mezzo a 121 ° C e 16 psi per 20 minuti. Noi non superiore a 500 ml di volume (per 1000 beuta ml), per evitare di dover agar solidificare prima di poter amministrare il tutto alle piastre di prova.
(Nota:.. E 'saggio quando si utilizzano mezzi alternativi, in particolare minimo agar nutriente con l'aggiunta di sali basale, per verificare prima che il vostro fungo prova si svilupperà su di esso Alta forza ionica in grado di inibire la crescita o addirittura uccidere il test isolare) - Utilizzare un portatile pipetta-aiuto e 10 ml di pipette sterili in polistirolo per trasferire agar asetticamente in un armadio biosicurezza, boccette, una volta freddi. Lasciando che i media freddi al tatto è importante per ridurre al minimo la condensa. Inoltre, pila piatti alta come sono versati, per ridurre al minimo l'acqua libera sui coperchi. Mentre la condensazione è un fastidio in coltura normale, qui rappresenta un grave problema se droplets forma e bagnare il legno. Contenuto di umidità (MC) oltre l'80% (sostanza secca) creerà anossia nei tessuti, il decadimento limite da funghi aerobica, e aumentare la variabilità. Calcolare MC come segue:
MC * = [(peso fresco peso a secco x) / peso a secco] x 100
* (MC può superare il 100% - questo può sembrare uno strano modo di calcolare MC, ma è di serie)- Microcosmi alternativi: se i tessuti vegetali sono testate che devono essere pre-macinato e setacciato (per esempio, mais Stover steli e foglie, insieme), ci sono due opzioni piatto che usiamo. Diviso piastre Petri sono disponibili con 2 o 4 sezioni, e agar può essere escluso da comparti con polvere. Agar solidificato può anche essere tagliato e rimosso una parte per lasciare spazio a polvere, ma bisogna fare attenzione a mantenere il volume di agar pari restante se la disponibilità di nutrienti deve essere controllata.
- Aggiungi generosamente taglio griglie in rete di plastica per la superficie della piastra, usando accuratamente lavati e sterilizzati in autoclave griglie aggiunto in modo asettico. Usiamo un prodotto, Guardia Gutter (35 x 50 mm, 2 mm di spessore), per la nostra maglia, e hanno utilizzato microscopia elettronica a scansione per mostrare una superficie pulita dopo il lavaggio con acqua e sapone e dimostrare una mancanza di penetrazione del fungo. Abbiamo avuto successo con filtri in fibra di vetro e con blocchi di posa direttamente sul miceli sviluppati, sia a causa di problemi di traspirazione. Otterrete decadimento, ma il tuo coefficiente di variabilità (CV) sarà alto, fare confronti trattamento statisticamente deboli. Abbiamo usato bacchette di vetro in precedenza, ma i blocchi sono suscettibili di scivolare aste quando urtavano, lasciando blocchi a contatto con l'agar. Una buona alternativa è di tagliare cerchi completi per soddisfare i piatti, il taglio un bordo al largo per ospitare inoculo. In generale, tagliare le griglie per adattare il proprio set-up, ma fare in modo che giaceva completamente pianeggiante nei piatti di Petri.
2) Preparazione del 'Blocco' substrati
Questi protocolli sono stati sviluppati per il legno massiccio, ma sono adattabili per altri tessuti vegetali. Perdita di massa è la misura standard per il progresso carie nel legno degradato da funghi filamentosi. Così, il nostro approccio utilizza pesi di asciugatura in forno pre-e post-decadimento per determinare la perdita di massa. Tuttavia, per qualsiasi ricerca per la bioenergia, dove il focus è sulla chimica tessuto vegetale, molti trovano che l'aria di essiccazione tessuti è preferibile. Mostriamo qui i protocolli per la preparazione agar-block culture di utilizzare a forno materiale di partenza, ma dare l'informazione alternativa all'aria secca e inoltre di elaborare in polvere invece di substrati solidi.
- Per questa dimostrazione, usiamo Southern Yellow Pine (SYP). SYP è disponibile in commercio del legname che rappresentano la stragrande maggioranza di legname utilizzato in edilizia residenziale negli Stati Uniti può essere uno qualsiasi dei quattro specie Pinus. Non trattati legname è usato e senza nodi blocchi sono tagliati da un unico strappo (taglio longitudinale) lungo il grano (19 x 19 mm). Questo riduce al minimo la variabilità chimica nel bosco. Questa lunghezza è tagliato in 19 mm 3 blocchi. Noi usiamo queste dimensioni per il suolo-block prove, e tagliato molti blocchi in una sola seduta ha visto sul tavolo.
- Mm 19 3 blocchi da utilizzare in agar-blocco microcosmi sono ulteriormente divisi a metà lungo il grano, utilizzando uno scalpello e martello, non una sega. Questo rende un bordo blocco grezzo a faccia in giù sulla maglia di plastica, e un bordo liscio verso etichetta. Blocchi di etichetta con la matita. Se non è possibile etichettare i vostri supporti, assicurarsi di escogitare un sistema per stare al passo con i campioni. Tagliare i blocchi abbastanza per soddisfare i trattamenti (di nuovo, si usa n = 5 per trattamento), così come non inoculato controlli che servirà sia come monitor di contaminazione e come campioni di riferimento dei dati, condizionato in parallelo.
- Per forno sostanza essiccata, campioni posto in un forno ventilato a 100 ° C per 48 ore. Se l'aria di sostanza essiccata è richiesto, le condizioni del campione in una camera o una stanza con umidità e temperatura costanti. Noi usiamo il 65% UR e 20 ° C, e di solito contare su 10-14 condizionata giorni, a seconda del materiale.
- Pre-pesare i vostri campioni per determinare il peso iniziale forno secco o fresco. Con campioni dal forno, è sufficiente trasferire campioni ad un essiccatore a raffreddare e pesare.
- Alternative aria asciugatura: Con aria secca materiale, prendere cinque campioni (n = 5; sacrificale questi non saranno utilizzati in microcosmi), pesare freschi, di asciugatura in forno come sopra, e pesare nuovamente dopo l'essiccazione. Calcolare un fattore di correzione dell'umidità per ciascuno dei due blocchi come segue:
Fattore di correzione MC = peso secco / peso fresco
Esempio: 2,46 g (a secco) / 2,68 g (freschi) = 0,918, così, un blocco di 3,0 g fresca è 2.75 g forno secchi
Media dei cinque campioni per ottenere il fattore medio di correzione. Poi, pesano tutti i blocchi di aria secca. Moltiplicare ogni peso per la media fattore di correzione per determinare MC iniziale di asciugatura in forno pesi.
- Alternative aria asciugatura: Con aria secca materiale, prendere cinque campioni (n = 5; sacrificale questi non saranno utilizzati in microcosmi), pesare freschi, di asciugatura in forno come sopra, e pesare nuovamente dopo l'essiccazione. Calcolare un fattore di correzione dell'umidità per ciascuno dei due blocchi come segue:
- Autoclave etichettati campioni a 121 ° C e 16 psi per 1 ora, o più a lungo con i più grandi campioni. Strettamente stagnola per minimizzare bagnante.
- Alternatisterilizzazione VE: raggi gamma possono essere utilizzati per sterilizzare, se disponibile. Abbiamo testato abete rosso e faggio in precedenza per gli effetti della temperatura sulla perdita di emicellulosa, e non ne trovò, insieme con nessuna perdita di forza o cambiare colore. Tuttavia, questo può variare tra i supporti e le vostre preferenze / esigenze, e la radiazione gamma è una valida alternativa.
- Per questa dimostrazione, stiamo testando il ruolo di solido gesso (puro verso 1% FeSO 4) sul degrado del nostro pino (SYP) campioni. Questi sono fatti, come i dischi con superfici e volumi esatti, ancora una volta di controllare la loro disponibilità, oltre alla loro concentrazione. Questi vengono sterilizzati in autoclave separatamente e aggiunti durante la fase di inoculo. Abbiamo bisogno di un disco per ogni blocco, e stiamo aggiungendo due blocchi per capsula di Petri per consentire due raccolti.
3) inoculo & Labeling
Inoculando agar-block microcosmi è più tempo rispetto inoculando suolo blocco vasetti. Per noi, contiamo su ogni inoculazione prendere 3 min. Per piastre Petri contenenti agar, questo è il punto di addizione per la maglia, il legno, le fonti esogene di nutrienti (in questo caso, pellets gesso), e il fungo. Vi è una maggiore probabilità di contaminazione a causa della quantità di tempo che il coperchio è aperto e il numero di visite all'interno. Ci sono anche diversi errori fondamentali che sono comunemente fatte in questa fase, e questi sono più coperti da accoppiamento video con il testo. Guarda il video.
- In un armadio sterile biosicurezza, assemblare i vostri piatti agar vuoto, un piatto di origine per il inoculo fungine (usiamo 2 culture settimana), maglia, substrato vegetale (legno), materiali esogeni, un imbroglione, strisce parafilm e strumenti per il trasferimento. Noi fiamma sterilizzare utilizzando etanolo al 70%, e usiamo uno strumento di trasferimento per l'inoculo e pinze per blocchi e rete. Parafilm dovrebbe essere tagliata con un rasoio per evitare scheggiature sui bordi. Nicks in parafilm portare a rompe quando di tenuta, e questo si accalcano campioni e richiedono una nuova entrata.
- Fiamma strumenti per il trasferimento o pinze prima di aggiungere il successivo (in questo ordine):
- Rete di plastica.
- Legno substrato. Per la nostra dimostrazione, aggiungeremo due blocchi di legno per tutta la lunghezza della maglia, sia dallo stesso blocco iniziale che è stato diviso in modo che possiamo coppia di dati raccolti dalla precoce e tardiva. Questi blocchi sono aggiunti fianco a fianco, con il grano di fine (legno sezione) di fronte al punto della sorgente di inoculo di funghi.
- Materiali esogeni. Qui, stiamo testando il ruolo di gesso sul decadimento da un fungo filamentoso. Quindi, vogliamo che il fungo di incontrare questi dischi di gesso prima di raggiungere il bosco, e quindi aggiungere un disco gesso tra ogni punto di inoculo e blocco sulla parte superiore della rete. Questo significa aggiungere 2 dischi al microcosmo. Non permettere il contatto tra i dischi e il legno, ma tenerli vicino.
- Inoculo di funghi. Usiamo un piralide # 4 sughero con 7 mm di diametro per fare tappi da 2-settimana culture cresciute in 20 ml di agar. Questo aiuta a controllare il volume di inoculo. Per i non inoculato controlli, è meglio aggiungere una spina da una piastra sterile. Noi di solito aggiungere questi tappi per l'agar, e non sulla rete. Non permettere il contatto tra l'inoculo e sia i substrati esogeni o il legno, ma ancora una volta, metterli vicini. C'è una spina inoculo per blocco.
Nota: E 'saggio per assemblare questi contenuti in un piatto di agar prima di iniziare a garantire ci saranno almeno 3 mm di spazio di testa, che ci saranno almeno 3 mm di distanza tra i blocchi di legno e le pareti coperchio, e che la vostra rete di plastica le dimensioni facilmente accomodare i vostri supporti.
- Piatti Parafilm per sigillare loro, mantenendo un ardente fiamma di alcool e con una pinza pronto. Tenere le piastre orizzontali e avvolgere parafilm in un movimento fluido continuo. In caso di rottura parafilm o se il contenuto spintonano, rimuovere parafilm, rientrare e assemblare i contenuti, e riprovare.
- Etichetta i coperchi piatto con un alcool-resistente marcatore, etichettatura numeri di blocco direttamente sopra la parte superiore di substrati rispettivi proprietari. Abbiamo anche disegnare cerchi sui dischi gesso. Come decade di legno, è probabile che perde la capacità di leggere l'etichettatura sui substrati. E 'importante tenere il passo con la posizione della parabola. Inoltre, non sottovalutare la possibilità di un fungo a degradare o colonizzare miriade di altri tipi di materiali, compresi i metalli.
- Se si dispone di assemblaggio delicato sulla rete, il trasferimento di piastre con attenzione per l'incubatrice. Abbiamo solo una volta, urtato lo scomparto di piatti contro un inceppamento della porta e ha dovuto rimontare le piastre. Prenditi il tuo tempo, e tracciare il percorso. Si tratta di un one-time preoccupazione, quindi attenzione questa volta.
4) L'incubazione e raccolta
Piastre possono essere incubate in base alle proprie fungo, ma dovrebbe essere tenuto in un incubatore biologico, se possibile, per evitare la condensa a causa di fluttuazioni di temperatura. Raccolti serie storiche sono fatto asettico, fatta eccezione per l'ultimo raccolto. Se questi raccolti intermedie vengono eseguite dopo la crescita susubstrati è significativo, la gestione delle piastre è più facile perché ife substrati collegamento trasversale.
- Per la nostra dimostrazione, incubare le piastre a 20 ° C e al buio. In un punto settimana 5 vendemmia, togliamo l'intero lotto di trattamento, ogni spruzzo basso e in alto con il 70% di etanolo e l'utilizzo forcipe fiammato per rimuovere il materiale all'interno dell'armadio biosicurezza.
- Scatta foto prima di distruggere piastre di agar, concentrandosi su qualsiasi morfologia o melanization.
- Rimuovere i blocchi devono essere trattati come le vostre esigenze richiedono. Usare le dita per rotolare via ife in eccesso (con guanti di nitrile), ma attenzione a non perdere alcun materiale decaduto. Noi di solito di asciugatura in forno blocchi di pentole in alluminio pesano per determinare la perdita di massa, utilizzando pesi freschi e secchi di controlli per monitorare traspirazione eccessiva. Abbiamo anche etichetta e blocca ogni traccia marrone scuro che sono chiaramente di acqua registrato, anche se questo dovrebbe essere minimo seguendo questo approccio. Dati di perdita di massa aiuta a misurare il progresso di decadimento, ed è un dato importante se le concentrazioni degli elementi devono essere calcolati su un grammo di peso base, più tardi. Ricordate anche che i dati percentuale deve essere normalizzato per le statistiche. Si calcola come segue:
% Di perdita di massa = [(peso iniziale peso finale) / peso iniziale] x 100- Alternative aria asciugatura: Se avete bisogno di aria di essiccazione, con l'obiettivo di trattare il materiale biologico ulteriormente, è necessario utilizzare il regime di condizionamento da sezione 2.3 di ricondizionare. Se è necessario determinare la perdita di massa, che richiederà una misura del contenuto di umidità, Una soluzione è quella di dividere i blocchi (o polveri) in una parte grandi e piccoli. Pesano entrambi, ma solo di asciugatura in forno la piccola porzione. Calcolare il contenuto di umidità fattore di conversione, come sopra, e poi applicarla al peso totale fresca di piccole porzioni + grandi (peso totale blocco fresco). Soprattutto se pretrattamento materiale con un fungo prima di saccarificazione o altri processi, perdita di massa vi aiuterà con determinazione bilancio di massa più tardi e rappresenta carboidrati consumati dal fungo.
- Distruggere le culture in sacchetti autoclavabili, ma salvare una rete di plastica di supporto e altri componenti che possono essere riciclati per l'uso in futuri esperimenti.
5) Interpretazione dei risultati
Tessuti lignocellulosici di solito decadimento più lento in agar-block design, ma a questo punto si dovrebbe avere variabilità relativamente bassa anche a livelli di decadimento moderato. Si dovrebbe anche avere moderata (20-50%), l'umidità non elevati nei tessuti di controllo.
- Contenuto di umidità (sulla base del peso secco) in legno non esposti a fungo sono generalmente moderati, circa il 40% in questa dimostrazione. Questo è al di sopra del punto di saturazione delle fibre (FSP) di pino (normalmente circa il 24%), il che significa che c'è un pò d'acqua libera in eccesso di acqua legata all'interno della parete cellulare lignocellulosica secondaria. Questo significa anche che alcuni si verifica la migrazione sulla probabile. Una umidità relativa del 100% non deve comunque consentire che il legno MC di superare la FSP. Il tuo disegno può ottenere risultati diversi a seconda del substrato e la selezione della maglia. La chiave è quello di mantenere contenuto di umidità inferiore all'85% o giù di lì, sulla base del peso secco.
- La perdita di massa% in legno degradato in questi microcosmi agar-blocco è di solito intorno al 30% dopo 16 settimane per la maggior parte dei funghi. Per selezionare i funghi, in questo caso lacrymans Serpula, funghi raggiungerà il degrado pieno in questo tempo, la perdita di massa> 60%. S. lacrymans è un fungo marciume bruno, la rimozione di lignina poco, così la perdita di massa del 62% in questo processo significa decadimento è di completamento o passato. Marcire i funghi bianchi rimuoverà lignina, e la perdita di massa dipende dalla specie, nonché come substrato.
- Fare attenzione a registrare morfologia ifale. In questa dimostrazione, la morfologia ifale non intrinsecamente mostrare successo o il fallimento di qualsiasi trattamento, ma i colori melanization erano importanti. Ci ha permesso di mettere in relazione il ruolo del ferro sotto forma di impurità in gesso ai vecchi studi come Low et al. (2000), dove sono stati testati materiali locali e dove questa 'ruggine' colorazione è stata osservata. Il ruolo del calcio e ferro sono stati dibattuti nel Basso et al. (2000), e qui vediamo decadimento arricchisce di ferro, non di calcio, e questi stessi color ruggine ife.
- Se si vuole misurare le concentrazioni di nulla in questo bosco degradato, è meglio per normalizzare per la perdita di massa. Se, per esempio, il calcio non è né importati o esportati da legno decaduto il 50%, la sua concentrazione sulla base del peso apparirà di raddoppiare da zero tempo per la raccolta finale. Questo perché 1 g di polvere ora rappresenta il doppio del volume di legno di quanto abbia fatto in tempo zero. Il fungo consuma il 50% della matrice, diminuendo la densità. Normalizzare una data concentrazione (per esempio mmol / g) per compensare la perdita di massa come segue:
Concentrazione normalizzato = mmol / gx [1 - (Massa perdita% / 100)]
Esempio: 10 mmol / g di Ca in legno degradato 20%, rispetto a 7 mmol / g al tempo zero.
Domanda: aumentare il contenuto di Ca durante il decadimento?
10 mmol / g è un apparente 3 mmol / g aumento, un aumento del 43%, ma one grammo di polvere di legno degradato con minore densità rappresenta oggi un volume maggiore. La normalizzazione è tenuto a confrontare iniziale e finale contenuto di Ca in volumi uguali di legno.
10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol / g normalizzato
Risposta: Si, Ca ha aumentato, ma non del 14%, 43%.
(I dati possono anche essere espresse per volume di legno, mmol / cm 3, moltiplicando per la densità.
Figura 1. Agar-blocco microcosmo, come indicato in questa manifestazione, prima di incubazione.
Figura 2. Lacrymans Serpula colonizzare blocchi di legno di pino che poggia su una rete di plastica per sollevare blocchi sopra di agar-contatto. Questo micelio rappresenta un importante collegamento tra legno e nutrienti esogeni / elemento fonti, e controllare queste fonti di materiale esogeno in agar o come materiali solidi è un vantaggio chiave di agar-block design, contro terra-block design.
Figura 3. Medio di perdita di peso%, come misura di estensione della carie del legno da lacrymans Serpula dopo 5 e 15 settimane con incubazione pino in agar-block microcosmi. Trattamento erano nessuno (Ca-free), 5 mM CaCl 2 aggiunta di agar-agar (CaCl 2),> 99% puro gesso (CaSO 4), o l'1% di ferro modificato gesso. Protetta ANOVA significa confronti sono stati utilizzando Tukey test, con α = 0,05. Per ogni raccolto, bar sotto la stessa lettera non sono significativamente differenti. Le barre di errore = deviazione standard. Pubblicato in Schilling (2010).
Figura 4. Dell'immagine Overhead (A) di tutte e cinque le repliche alla settimana 15 di decadenza dal fungo stesso marrone prova marcire, lacrymans Serpula, così come i blocchi (B) rimossi e forno secchi. Si noti la mancanza di melanization a Ca trattamento senza, l'ingiallimento nei trattamenti di calcio puro, e la comparsa di ruggine in ferro-modificato il trattamento. I trattamenti sono etichettati come nella figura 3, con il controllo in blocchi (B) è non inoculato per il confronto.
Figura 5. Immagine luminosa di una prova diversa con una più alta concentrazione media di ferro, agar malto di Blakeslee. Rilevare la perdita di melanization osservato, rispetto ai Figura 4. Blocchi rimossi e pesato non ha mostrato alcun effetto del trattamento sulla perdita di peso. Questo si presenta come una dimostrazione dell'influenza dei componenti esogene di questi studi blocco. Questi effetti non sarebbe verificabile nel suolo blocco disegni vaso, dove questi ingressi esogeni sono troppo difficili da controllare.
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Discussion
Utilizzando il nostro agar-block set-up (Figura 1) lacrymans Serpula cresciuto a diretto contatto con le superfici in gesso e in blocchi di legno (Figura 2), portando a oltre il 60% di perdita di peso nel marrone-decomporsi controllo blocchi di pino (Figura 3 ). Questo soddisfa facilmente l'obiettivo standard ASTM di decadimento> 50% e il coefficiente medio di variazione (C V) nel decadimento in era 0,055 alla settimana 16. Questi dati vengono pubblicati in Schilling 7. Ancora una volta, altri funghi richiederà più di incubazione in agar-block che nel suolo-block. Per riferimento, abbiamo eseguito con successo progetti simili in diversi esperimenti passati con una varietà di altre specie fungine, spesso utilizzando microscopia elettronica a scansione con la spettroscopia dispersiva di elettroni (SEM-EDS) e plasma ad accoppiamento induttivo spettroscopia (ICP-OES) per verificare la connettività con esogeni substrati e traslocazione di calcio e altri elementi in legno 8,9.
Oltre alla bassa variabilità, ci sono due altri risultati che la nostra agar-block disegno rivela. In primo luogo, vi era un effetto del trattamento (Figura 3), dove il nostro aggiunte di calcio, se l'agar come CaCl 2 o come puro gesso, inibito decadenza da questo fungo. Si tratta di un risultato utile perché gli altri hanno teorizzato calcio migliora decadenza sulla base di studi del mondo reale materiali come malte e intonaci. Invece, vediamo i tassi di decadimento rimbalzo con l'aggiunta di ferro al gesso, suggerendo di ferro, non di calcio, è fondamentale. Il secondo risultato utile, però, non è quantificato, ma è invece il colore del miceli (Figura 4). Ci sono differenze significative melanization ed evidente in ife esterne tra i trattamenti, ei ricercatori hanno osservato in precedenza melanization 'ruggine' quando incontra questo fungo sui materiali da costruzione (es. Low et al. 2000). Nei nostri studi più recenti, abbiamo scoperto che questi effetti si perdono con un ferro medio-alta (Figura 5). Collettivamente, suggerisce che questo fungo non utilizza ferro, calcio, di queste materie e che gli studi precedenti, con 'arrugginito' miceli riferito, stavano osservando effetto ferro, non effetto di calcio.
Nel complesso, questi risultati e la mancanza degli effetti del trattamento con alte ferro agar sono una dimostrazione molto forte del controllo che l'agar-block di progettazione in grado di fornire il ricercatore, soprattutto alla luce delle alternative suolo approccio a blocchi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Nalge Nunc international | 4014 | 25 x 150 mm |
| Agar, Type A | Sigma-Aldrich | A4550 | |
| Ammonium nitrate, NH4NO3 | Millinckrodt | 3436-12 | |
| Potassium phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | |
| Magnesium sulfate 7-hydrate, MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Dextrose |
| Boric acid, H3BO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 2549-04 | |
| Zinc sulfate 7-hydrate, ZnSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 8880-12 | |
| Manganous chloride 4-hydrate, MnCl2•4H2O | JT Baker | 2540-04 | |
| Copper(II) sulfate 5-hydrate, CuSO4•5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Ammonium heptamolybdate 4-hydrate, (NH4)6Mo7O24•4H2O | Sigma-Aldrich | 431346 | |
| Calcium chloride dihydrate, CaCl2•2H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 4160-12 | |
| Sodium chloride, NaCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581-12 | |
| Ferrous sulfate 7-hydrate, FeSO4•7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 5056-12 | |
| Pipet-aid | Drummond Scientific | 4-000-110 | Cordless EtOH the surface |
| 10 ml sterile polystyrene pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| Gutter Guard | Thermwell Products Co. | VX620 | Pre-scrubbed with soap Hardware store |
| Calcium sulfate hemihydrate, CaSO4•0.5H2O | Acros Organics | 385355000 | |
| #4 cork borer | Boekel Scientific | 1601 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 |
References
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