Rapido PCR termici utilizzando microscala convezione termica

Summary

Descriviamo un nuovo metodo per eseguire la replicazione del DNA tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Convezione termica viene sfruttata per reagenti navetta continuo tra denaturazione, ricottura, e le condizioni di estensione, mantenendo opposte superfici del reattore a temperatura costante. Questo design intrinsecamente semplice promette di rendere rapido PCR più accessibile.

Abstract

Molti test di biologia molecolare dipendono in qualche modo la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare un inizialmente diluire il campione di DNA bersaglio a livelli di concentrazione rilevabile. Ma la progettazione di hardware convenzionale termocicli PCR, prevalentemente sulla base di massicci blocchi di riscaldamento metallo la cui temperatura è regolata da riscaldamento termoelettrico, limita fortemente la velocità raggiungibile di reazione ^1. Notevole energia elettrica è necessaria anche per riscaldare e raffreddare ripetutamente la miscela di reazione, limitando la possibilità di distribuire questi strumenti in un formato portatile.

Convezione termica è emerso come un approccio promettente termici alternativa che ha il potenziale per superare queste limitazioni ^2-9. Flussi convettivi sono all'ordine del giorno in una vasta gamma di impostazioni che vanno dalla atmosfera terrestre, gli oceani, e gli interni, di lampade lava decorativa e colorata. Movimento fluido è iniziato nello stesso modo in ogni caso: una instabilità dell'assetto guidato nasce quando un volume limitato di liquido è sottoposto ad un gradiente di temperatura spaziale. Questi stessi fenomeni offrire un modo interessante per eseguire termici PCR. Applicando un gradiente di temperatura statica attraverso una geometria del reattore concepiti in modo appropriato, un continuo flusso circolatorio può essere stabilito che ripetutamente trasporto reagenti PCR attraverso zone di temperatura associata alla denaturazione, ricottura, estensione e le fasi della reazione (Figura 1). Termici può quindi essere azionato in una pseudo-isotermico maniera semplicemente tenendo due superfici opposte a temperature fisse, eliminando completamente la necessità di riscaldare e raffreddare ripetutamente lo strumento.

Una delle principali sfide per la progettazione di termociclatori convettiva è la necessità di controllare con precisione la velocità spaziale e distribuzione della temperatura all'interno del reattore per assicurare che i reagenti in sequenza occupano le zone di temperatura corretta per un periodo di tempo sufficiente ^10,11. Qui si descrivono i risultati dei nostri sforzi per sondare la piena 3-D di velocità e distribuzione della temperatura in microscala convettivo termociclatori ^12. Inaspettatamente, abbiamo scoperto un sottoinsieme delle traiettorie di flusso complessi che sono molto favorevoli per PCR a causa di una combinazione sinergica di (1) lo scambio continuo tra i percorsi di flusso che offre l'opportunità migliore per i reagenti per assaggiare l'intera gamma di profili di temperatura ottimale, e ( 2) aumento del tempo speso all'interno della zona di temperatura estensione il fattore limitante della PCR. Estremamente rapidi tempi di amplificazione del DNA (sotto i 10 min) sono realizzabili in reattori progettati per generare questi flussi.

Protocol

1. Progettazione di base del termociclatore convettivo Abbiamo costruito un dispositivo semplice ciclo termico convettivo composto da intercambiabili in plastica reazione da camera "cartucce" che sono inserito tra due lastre di alluminio le cui temperature sono controllati indipendentemente 7 (Figura 2). Pozzi reattore cilindrico vengono incorporati per gli array lavorazione di fori in blocchi in policarbonato, con diverse combinazioni di diametro del foro e spessore del foglio di plastica utilizzato per ottenere le proporzioni desiderate (altezza / diametro = h / d). Due diverse geometrie del reattore sono considerati nei risultati qui presentati: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 microlitri volume; h / d = 3: h = 6.02 mm, d = 1,98 millimetri, 18,5 microlitri volume. La superficie inferiore del reattore è riscaldata utilizzando un blocco di alluminio contenenti riscaldatori a cartuccia interfacciato con un regolatore di temperatura guidato microprocesser. La temperatura alla superficie superiore del reattore è regolata utilizzando un blocco di alluminio collegato a un bagno d'acqua di ricircolo. Tutta l'assemblea è bloccato insieme usando viti di nylon per limitare conduzione termica tra i blocchi contrapposti in alluminio. 2. Preparazione e caricamento della miscela di reazione PCR Una tipica miscela di reazione 100 microlitri contiene 10 ml di soluzione tampone 10x, 6 ml di 25 mM MgCl 2, 10 l di dNTPs (2 mm ciascuno), 41,2 ml di acqua deionizzata, 10 ml di β-actina sonda, 10 ml di β -actina in avanti fondo, 10 ml di β-actina fondo inverso, 2 l di DNA umano modello genomico (10 ng / mL) e 0,8 l di DNA polimerasi KOD (2,5 unità / mL). Prima di caricare i reagenti, sigillare la superficie inferiore della camera di PCR utilizzando un sottile strato di nastro di alluminio. Sciacquare i pozzi reattore con 10 mg / mL di soluzione acquosa di albumina sierica bovina seguito da Rain-X Anti-Fog. Reagenti Pipettare nei pozzetti reattore usando lungo gel-loading puntali e sigillare la superficie superiore con del nastro Teflon FEP. 3. Esecuzione della reazione nel termociclatore convettivo Prima di iniziare la reazione, preriscaldare i due blocchi di alluminio per le temperature desiderate superficie superiore e inferiore. Sandwich il reattore di plastica cariche di reagenti PCR tra i blocchi di riscaldamento in alluminio, e rapidamente morsetto l'assemblea insieme con le viti in nylon. Dopo la reazione è proceduto per il tempo desiderato, spegnere il riscaldamento e il luogo inferiore (a caldo) della superficie del dispositivo sulla cima di un blocco di metallo refrigerato per raffreddare rapidamente e fermare il flusso convettivo. Rimuovere il reattore di plastica e pipetta prodotti dalle fonti (con punte di carico lungo il gel) per successive analisi. 4. Esecuzione di analisi gel elettroforesi Preparare un peso del 2% gel riscaldando 10 g di agarosio con 500 ml di tampone 1x su un piatto caldo mescolando fino a quando la soluzione diventa chiara. Caricare il gel nel cassetto casting e inserire il pettine. Lasciate che i set di gel per circa 30 min. Togliere il pettine e aggiungere 1x tampone TAE fino a quando il gel è sommerso. Fluorescenza campioni di DNA macchiato contenere 2 microlitri 100x SYBR Green soluzione I, 2 campione di DNA microlitri, 2 microlitri 6x Dye Caricamento Orange, e 4 microlitri di buffer TAE. Aggiungere i campioni di DNA nei pozzetti ed eseguire il distacco a 60 V per 1 h con un DNA di 100 bp scala marcatore dimensionamento. Rimuovere il gel e fotografare sotto la luce UV per ottenere il risultato. 5. Rappresentante dei risultati: Progettazione ottimale di termociclatori convettivi comporta la scelta della corretta geometria del reattore che genererà un flusso circolatorio in grado di trasportare i reagenti attraverso le temperature chiave coinvolti nel processo di PCR. I parametri geometrici che possono essere modificate in reattori cilindrici qui considerati sono l'altezza (h) e diametro (d), o equivalentemente il rapporto di aspetto (h / d). Abbiamo esplorato il 3-D campi di flusso convettivo all'interno dei reattori PCR su una gamma di differenti formati utilizzando fluidodinamica computazionale (CFD), ed ha trovato che i modelli complessi possono insorgere inaspettatamente. Ancora più importante, la nostra analisi ha scoperto un sottoinsieme di questi campi di flusso complessi che accelerare in maniera significativa la reazione 12. Questi effetti geometrici può essere vista chiaramente confrontando i campi di flusso nei reattori a proporzioni alte e basse. Nel caso in alto rapporto di aspetto (h / d = 9; un alto, magro cilindro), elementi fluidi sono convogliati lungo traiettorie tracciare percorsi che sono essenzialmente perimetri chiusi, e sono locked-in per seguire gli stessi percorsi per lunghi periodi di tempo (Figura 3a). Di conseguenza, ci sono poche opportunità di scambio tra ftraiettorie basso che esporre i reagenti per la sequenza ottimale delle condizioni termiche per la PCR (oscillante tra il ricottura e denaturazione estremi sulle superfici superiore e inferiore del reattore) e l'insieme molto più grande di traiettorie rimanenti che non contribuiscono alla amplificazione (localizzata vicino al centro del reattore). Il campo di flusso è molto diverso in un rapporto di formato più piccolo (h / d = 3; una più breve, cilindro più ampio), diventando sempre più caotica, nel senso che le traiettorie elemento fluido non seguono più tracciati chiusi (Figura 3b). Così, anche se i reagenti vengono sottoposti ad un profilo di temperatura più complesso, elementi fluidi sono in grado di esplorare una gamma molto più ampia di traiettorie in modo che più del volume di reagente ha l'opportunità di un'esperienza ottimale profili termici. Counterintuitively Questi risultati suggeriscono che, mentre le traiettorie del flusso singoli h / d = 9 può apparire più favorevole per PCR con la produzione di profili di temperatura che "look" simile a quelli impiegati in un termociclatore convenzionale, la natura caotica del campo di moto in h / d = 3 domina in ultima analisi, su scala globale, promuovendo lo scambio migliorato in modo che i reagenti non restare intrappolati nelle traiettorie sfavorevoli per molto tempo. Per verificare questa ipotesi e stabilire quali la geometria del reattore è stata più favorevole per la PCR, abbiamo usato tutti e due a eseguire la replica di un obiettivo PCR 295 bp associata alla β-actina gene da un modello umano del DNA genomico. Sorprendentemente, abbiamo raggiunto regolarmente l'amplificazione del prodotto bersaglio corretto in soli 10 min a h / d = 3 (Figura 4a), mentre la stessa reazione richiesto almeno 20 minuti prima che i prodotti rilevabili sono stati osservati h / d = 9 (Fig. 4b) . La specificità di reazione è molto maggiore di h / d = 3, dove un singolo prodotto PCR è ottenuta, pur essendo più prodotti non specifici vengono generati h / d = 9 dove le trappole flusso di elementi fluidi in campo sfavorevole traiettorie termica per lunghi periodi di tempo. Figura 1. Convezione termica in una camera cilindrica di cui sopra e sotto le superfici sono mantenuti a diverse temperature fisso. Se la temperatura alla superficie inferiore è più alto nella parte superiore, un gradiente di densità verticale è stabilita entro il fluido racchiuso in grado di generare un modello di flusso circolatorio. Con la giusta scelta dei parametri geometrici (altezza h e diametro d), il campo di flusso convettivo può essere sfruttata per azionare termici PCR quando le superfici superiore e inferiore sono manintained vicino ricottura e denaturazione temperature, rispettivamente (gravità agisce verticalmente verso il basso). Figura 2. (A) I componenti chiave di un flusso convettivo PCR thermocyler. Una cartuccia reattore è costituito da un blocco di policarbonato contenente una serie di camere cilindriche. Il blocco è inserita tra una piastra superiore progettato per essere collegato ad un bagno d'acqua in circolazione e un piatto fondo incorporando riscaldamento incorporato. (B) I reagenti PCR vengono caricati e sigillati all'interno della cartuccia reattore, dopo di che il dispositivo è montato di effettuare la reazione. Al termine, la procucts può essere facilmente pipettati per successive analisi. Figura 3. Simulazioni computazionali di 3-D campi di flusso convettivo generato all'interno dei reattori cilindrici con temperature di 53 e 96 ° C imposto alle superfici superiore e inferiore, rispettivamente. I risultati sono mostrati in proporzioni di (a) h / d = 9 (38.2 volume del reattore mL) e (b) h / d = 3 (18.5 volume del reattore mL). Un rappresentante traiettoria seguita da un elemento fluido che viaggiano attraverso il campo di flusso 3D è visibile a sinistra insieme a proiezioni di vista superiore e laterale del percorso, la trama corrispondente della temperatura in funzione del tempo a seguito di un elemento fluido è mostrato a destra. Il profilo termico in h / d = 9 sembra vicina a quella di un termociclatore convenzionale, ma il campo di flusso caotico di h / d = 3 è counterintuitively più favorevole per la PCR. Figura 4. Replicazione del DNA risultati ottenuti nelle geometrie del reattore mostrato nella Figura 3 (superiore ed inferiore superfici sono state mantenute a 53 e 96 ° C, rispettivamente). (A) PCR è fortemente accelerato a h / d = 3, come risulta evidente dai prodotti forti visibili dopo soli 10 minuti di tempo di reazione (M: 100 bp scaletta, corsie 1-4: i prodotti da reazioni parallele in 4 differenti camere cilindriche). (B </strong>) La stessa reazione eseguita h / d = 9 sono necessari almeno 20 minuti prima che i prodotti visibili sono osservate, e le bande sono più evidenti che indicano la replicazione del DNA non specifico obiettivo, oltre al prodotto desiderato (M: 100 bp scala, corsie 1-2: i prodotti da reazioni parallele in due differenti camere cilindriche).

Discussion

L'interazione tra flusso e la reazione chimica può cambiare drasticamente sotto l'influenza di avvezione caotica. Ma questi stati di flusso complessi sono difficili da studiare, in particolare nelle geometrie reale, in cui gli effetti 3D diventano importanti. Rayleigh-Bénard convezione a / p> 1 non solo fornisce una comoda piattaforma per esplorare questi fenomeni, la loro applicazione per eseguire PCR permette anche l'accoppiamento tra flusso e reazioni chimiche di essere indagato. Questa funzionalità unica consente di selezionare gli stati di flusso ottimale dove caotico agire effetti (counterintuitively) per accelerare la velocità di replicazione del DNA.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
KOD DNA Polymerase kit		Novagen	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit		Applied Biosystems	401846
Aluminum tape		Axygen, Inc.	PCR-AS-200
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog		SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips		Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape		McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel		Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer		Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I		Invitrogen/Molecular Probes	S7563
6x Orange Loading Dye		Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker		Bio-Rad	170-8202