Una preparación aislada de retina para registrar la respuesta de la luz a partir de semillas etiquetadas las células ganglionares retinianas
Summary
Este artículo proporciona una descripción de cómo analizar y record de la preparación aislada de la retina en el ratón. En particular, se describe la forma de registrar las respuestas de la luz de una población de células ganglionares marcados con fluorescencia y, posteriormente, identificar y analizar su morfología.
Abstract
Los primeros pasos en la visión de los vertebrados tienen lugar cuando la luz estimula los fotorreceptores de los bastones y conos de la retina 1. Esta información es luego separada en lo que se conoce como las vías de ON y OFF. La información fotorreceptores señal de luz a las células bipolares (BC), que despolarizan en respuesta a los aumentos (en BC) o disminuye (Off BCS) en la intensidad de luz. Esta separación de la luz información se mantiene en el nivel de las células ganglionares de la retina (CGR), que tienen dendritas estratificación, ya sea en el sublamina fuera de la capa plexiforme interna (IPL), donde reciben la entrada de excitación directa de Off chalecos, o la estratificación en En el sublamina de la IPL, donde reciben la entrada de excitación directa de El BCS. Esta segregación de información acerca de los aumentos o disminuciones en la iluminación (el encendido y apagado vías) se conserva y señaló que el cerebro de forma paralela.
La CGR son las celdas de salida de la retina, y por lo tanto una importante célula de estudio con el fin de entender cómo la luz información es transmitida al núcleo visual en el cerebro. Los avances en la genética del ratón en las últimas décadas han dado lugar a una variedad de líneas fluorescentes reportero del ratón en poblaciones específicas de RGC están etiquetados con una proteína fluorescente para permitir la identificación de los subtipos de RGC 2 3 4 y orientación específica para el registro electrofisiológico. A continuación, presentamos un método para registrar las respuestas de la luz de las células ganglionares de la etiqueta fluorescente en una preparación intacta, la retina aislada. Esta preparación la retina aislada permite grabaciones de CGR en la glorieta dendríticas está intacto y las entradas a través de la glorieta dendríticas RGC todo se conservan. Este método es aplicable en una amplia variedad de subtipos de células ganglionares y se presta a una amplia variedad de una sola célula técnicas fisiológicas.
Protocol
Discussion
Esta técnica es aplicable a todas las grabaciones de células ganglionares de la retina de una retina aislada. Aunque en la línea de ratón utilizado anteriormente intrínsecamente fotosensibles, melanopsina expresar CGR se etiquetan con EGFP 2, 5, este protocolo es fácilmente transferible a otras líneas de marcado con fluorescencia RGC o puede ser generalizada para grabar desde CGR seleccionados al azar también. Esta técnica es particularmente útil debido a que el cenador dendríticas de cada CGR y su…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Damos las gracias a Darwin la horca por su asistencia técnica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
Riferimenti
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