Protocollo per ricombinante RBD-based Vaccines SARS: Preparazione di proteine, vaccinazione degli animali e la rivelazione di neutralizzazione

Summary

Questo protocollo descrive una procedura generale per lo studio ricombinante del recettore dominio di legame (RBD) a base di vaccini a subunità contro la SARS. Esso include metodi per la trasfezione ed espressione di proteine ​​nelle cellule 293T RBD, l'immunizzazione di topi con RBD e la rilevazione di attività di neutralizzazione del mouse utilizzando un siero stabilito pseudovirus SARS saggio di neutralizzazione.

Abstract

Sulla base del loro profilo di sicurezza e la capacità di indurre potenti risposte immunitarie contro le infezioni, vaccini a subunità sono stati usati come candidati per una vasta gamma di agenti patogeni ^1-3. Dato che il sistema delle cellule di mammifero è in grado di modificazioni post-traduzionali, in modo da formare le proteine ​​accuratamente piegati e glicosilata, proteine ​​ricombinanti espresse in cellule di mammifero hanno dimostrato il potenziale maggiore per mantenere alta l'antigenicità e immunogenicità ^4-6.

Sebbene non nuovi casi di SARS sono stati segnalati dal 2004, future epidemie sono una minaccia costante, quindi, lo sviluppo di vaccini contro la SARS-CoV è un passo prudente preventiva e deve essere effettuata. L'RBD di proteine ​​SARS-CoV S svolge un ruolo importante nel legame recettore e induzione di specifici anticorpi neutralizzanti contro l'infezione da virus ^7-9. Pertanto, in questo protocollo, si descrivono nuovi metodi per lo sviluppo di un vaccino basato RBD subunità contro la SARS. In breve, la proteina ricombinante RBD (rRBD) è stato espresso in supernatante della coltura di cellule di mammifero 293T per ottenere una proteina correttamente ripiegata con conformazione corretta e l'immunogenicità di alta ^6. La transfezione della codifica RBD plasmide ricombinante per le cellule è stata poi effettuata utilizzando un metodo di fosfato di calcio trasfezione ^6,10 con alcune modifiche. Rispetto al metodo di trasfezione lipidi ^11,12, questo metodo modificato fosfato di calcio transfezione è più conveniente, più facile da gestire, e ha il potenziale per raggiungere elevata efficacia una volta un complesso di transfezione con dimensioni adatte e la forma è formata ^13,14. Infine, un saggio di neutralizzazione pseudovirus SARS è stato introdotto nel protocollo e utilizzati per rilevare l'attività neutralizzante di sieri di topi vaccinati con proteine ​​rRBD. Questo test è relativamente sicuro, non comporta alcuna infettive SARS-CoV, e può essere eseguito senza la necessità di un laboratorio di biosicurezza-3 ^15.

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato anche per la progettazione e lo studio vaccini a subunità ricombinanti contro altri virus con classe I proteine ​​di fusione, per esempio, l'HIV, il virus respiratorio sinciziale (RSV), virus Ebola, virus dell'influenza, così come virus Nipah e Handra. Inoltre, i metodi per generare un pseudovirus e, successivamente, che istituisce un saggio di neutralizzazione pseudovirus può essere applicato a tutti questi virus.

Protocol

1. Ricombinante SARS-CoV RBD proteine ​​preparazione Preparare fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione 2X preparazione tampone HBS: Mescolare 16 g di NaCl, 0,4 g di Na 2 HPO 4 * 7H 2 O e 13,0 g di HEPES. Regolare il pH a 7,00 e portare il volume totale di 1000 ml di acqua distillata. Dopo il filtraggio la soluzione per la sterilizzazione, aliquota e conservarlo a -20 ° C. Suggerimento: Ogni variazione del valore di pH potrebbe influenzare i risultati di trasfezione. Quindi, si consiglia di testare diversi valori di pH intorno a 7,00 (per esempio, 6,99, 7,00 o 7,01) e trovare la migliore per la trasfezione con il metodo introdotto di seguito. 2,5 M CaCl 2 Preparazione: Aggiungere 73,5 g di CaCl 2 * 2H 2 O in acqua distillata in un volume finale di 200 mL. Filtrare la soluzione e conservare a -20 ° C. Trasfezione plasmide ricombinante e purificazione di proteine Dividere le celle 293T al 50-70% confluenza 24 ore prima di trasfezione. Crescere le cellule di T-175 palloni tessuto cm 2 cultura in 40 ml di DMEM contenente 10% di siero (HI) FBS e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in 5% di CO 2. Tutti i reagenti di trasfezione deve essere portato a temperatura ambiente prima di trasfezione. Questi reagenti sono HBS 2X, 2.5M CaCl 2, DIH 2 O, e rRBD plasmide 6. Suggerimento: Il plasmide ricombinante finale costrutto usato per l'espressione delle proteine ​​dovrebbe contenere un peptide segnale per garantire la secrezione di proteine ​​ricombinanti espresse al supernatante della coltura. Un 6x suoi tag possono essere aggiunti al C-terminale della proteina espressa per la purificazione facile. Preparare un 50 ml (A) e uno da 15 ml (B) BD tubo Falcon, e aggiungere i reagenti per i tubi, come indicato nella tabella 1. Aggiungi 2X tampone HBS ad A. Tubo in tubo B, aggiungere 2,5 M CaCl 2 e rRBD plasmide, e portare il volume al requisito in DIH 2 O. A. Un T-175 cm 2 cultura fiasco tessuti (4000 microlitri / cilindro): prepararsi per l'espressione rRBD Un tubo Tubo B HBS 2X 2000 microlitri 2,5 M CaCl 2 200 l rRBD DNA plasmidico 40 mcg DIH 2 O a 2000 microlitri B. One 100 mm scatola di Petri (1000 ml / piatto): prepararsi per la produzione di pseudovirus SARS Un tubo Tubo B HBS 2X 500 microlitri 2,5 M CaCl 2 50 microlitri DNA plasmidico SARS-CoV S 5 mcg HIV-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) 5 mcg DIH 2 O a 500 microlitri Tabella 1. Miscela di preparazione Transfection e volumi I volumi elencati nella Tabella 1 sono per una unità di trasfezione. Se più fiaschi o piatti vengono utilizzati per la transfezione, regolare i volumi di conseguenza. Aggiungere il DNA di calcio soluzione in B tubo nel tubo A in maniera goccia a goccia, pur mantenendo costante e dolce mescolando in un vortice. Lasciate il composto a temperatura ambiente per 20-30 min. La chiave per il successo di trasfezione fosfato di calcio dipende dalle dimensioni e la forma del precipitato formato. Così, la miscela deve essere costantemente in agitazione e lentamente per soddisfare questo requisito e, di conseguenza, migliorare l'efficacia di trasfezione. Aggiungete il composto in maniera goccia a goccia e anche in cellule 293T (4000 microlitri / fiasco). Cellule cultura in incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2. Sostituire il terreno di coltura fresca senza siero OPTI-MEM ho ridotto-siero Media (50 mL / beuta) 8-10 ore dopo la trasfezione. Continuare a celle di coltura per due giorni nelle stesse condizioni. Raccogliere il supernatante contenente proteine ​​espresse rRBD 72 h post-trasfezione. Centrifugare a 6000 rpm per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Aggiungi cocktail inibitore della proteasi per il supernatante raccolto e conservare a 4 ° C durante la notte. Il giorno dopo, purificare rRBD proteina ricombinante dal supernatante della coltura utilizzando le istruzioni Ni-NTA produttore Superflow successivo. Concentrato di proteine ​​purificate utilizzando Amicon Ultra tubi concentrazione -15. Dopo la concentrazione di proteine,aggiungere PBS ai tubi concentrazione e centrifugare di nuovo per rimuovere imidazolo in tampone di eluizione. Calcolare la concentrazione di proteine ​​e conservare le proteine ​​purificate a -80 ° C fino al momento dell'uso. 2. Immunizzazione del mouse e Prelievo dei campioni Preriscaldare Sigma sistema adiuvante (SAS) a 40-45 ° C secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 1 ml di PBS per flacone e mescolare accuratamente. Preparare proteina-adiuvante emulsione secondo il protocollo nella tabella 2. Pipetta calcolato proteina rRBD in un tubo di 1,5 ml. Aggiungere uguale volume di SAS adiuvante per il tubo e agitare vigorosamente per 2-3 minuti per formare emulsione. Suggerimento: I volumi elencati nella tabella 2 sono per un mouse. Regolare i volumi secondo i numeri del mouse effettivamente utilizzato. Per ogni gruppo, si mescolano le proteine ​​e adiuvante necessari per ogni vaccino. Sempre preparare un campione in più per la vaccinazione per garantire l'accuratezza. Gruppo 1 ° vaccino (200 l / mouse) 2 ° vaccino (200 l / mouse) 3 ° vaccino (200 l / mouse) rRBD proteina 20 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS 10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS 10 mg di proteine ​​in PBS (100 mL) + 100 ul SAS PBS controllo 100 ul PBS + 100 ul SAS 100 ul PBS + 100 ul SAS 100 ul PBS + 100 ul SAS Tabella 2. Mouse immunizzazione protocollo Per via sottocutanea in prima serata immunizzare femminile topi BALB / c (4-6 settimane, 5 topi / gruppo), e aumentare due volte con rRBD e SAS, come indicato nella tabella 2. Usa PBS gruppo come il controllo. Il sito per iniezioni sottocutanee di solito scelto è la pelle flaccida tra le scapole. In alternativa, l'addome ventrale è comunemente usato, perché è più facile da iniettare, e può osservare eventuali perdite dai siti di iniezione. Quando dosi ripetute di vaccini vengono utilizzati, è facile selezionare i siti di iniezione diversi, evitando potenziali reazioni cutanee locali. Bleed topi via retro-orbitale con anestetico prima vaccinazione e 10 giorni dopo ogni vaccinazione, e il calore siero a 56 ° C per 30 minuti per inattivare il complemento. Conservare il mouse siero a -20 ° C fino al momento dell'uso. 3. Neutralizzazione di rilevamento utilizzando neutralizzazione saggio Pseudovirus Preparare pseudovirus SARS Dividere le celle 293T in 100 piatti della cultura millimetro di tessuto di Petri (2×10 6 cellule / piatto) 16 h prima di trasfezione, le cellule e far crescere come sopra. Preparare i reagenti di trasfezione, come indicato nella tabella 1. Proteine ​​co-trasfezione una codifica plasmide SARS-CoV S e una codifica plasmide Env-difettoso, luciferasi che esprimono genoma dell'HIV-1 (pNL4-3.luc.RE) con fosfato di calcio dei reagenti di trasfezione. Sostituire media con 10 ml fresca DMEM contenente 10% FBS e 1% P / S 8-10 ore dopo la trasfezione. Raccogliere il supernatante contenente pseudovirus SARS 72 h post-trasfezione. Pseudovirus filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aliquota e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. SARS pseudovirus test di neutralizzazione Dividere le celle 293T esprimono SARS-CoV recettore ACE2 (ACE2/293T) a 10 4 cells/100 microlitri / pozzetto in piastre da 96 pozzetti tessuto cultura 16 h prima dell'infezione. Diluire pseudovirus SARS da 2 volte a rilevare il titolo del virus nelle cellule ACE2/293T. Serialmente diluire i sieri del mouse in lastre di tessuto da 96 pozzetti cultura, e aggiungere uguale volume di titolato pseudovirus SARS. Preincubare le piastre a 37 ° C per 1 h. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri della Sera-pseudovirus miscela di cellule ACE2/293T, e continuano a crescere le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2. Aggiungi fresca DMEM 24 ore più tardi. Rimuovere completamente sovranatanti dalle piastre 72 ore dopo l'infezione. Aggiungi 1X luciferasi cultura reagente di lisi cellulare (60 microlitri / pozzetto), e promuovere la lisi cellulare con costante agitazione di piastre per 1-2 ore a temperatura ambiente. Trasferimento lisati cellulari (50 ml / pozzetto) in piastre luminometro (Microfluor piastre a 96 pozzetti). Aggiungere substrato luciferasi (50 ml / pozzetto) inclusi nel sistema di analisi luciferasi, e di rilevare l'attività relativa luciferasi in Ultra 384 luminometro. Calcolare titolo pseudovirus SARS neutralizzazione e presente come il 50% titolo di anticorpi neutralizzanti (NT 50) 6.

Discussion

Densità delle cellule è un fattore importante per l'efficacia di fosfato di calcio a base di trasfezione. Nella nostra esperienza, meno del 70% confluenza delle cellule porta i migliori risultati. Pertanto, al fine di migliorare l'efficienza di trasfezione, si raccomanda che la densità delle cellule mantenuto a circa 50-70% di confluenza. Il fosfato di calcio metodo di trasfezione è generalmente ritenuto meno efficiente rispetto ai metodi di transfezione altri, come la transfezione lipidi ^16. Tuttavia, in questo protocollo, abbiamo usato una versione modificata del metodo di fosfato di calcio trasfezione cui costante e lenta miscelazione della soluzione di trasfezione in un vortice assicura la formazione di un precipitato con la dimensione appropriata e la forma, migliorando così l'efficienza di trasfezione.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
NaCl		Sigma	S7653
Na2HPO4*7H2O		Sigma	S2429
HEPES		Sigma	H3375
CaCl2*2H2O		Sigma	C5080
DMEM		Invitrogen	12430
HI FBS		Invitrogen	10438
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140
OPTI-MEM I Medium		Invitrogen	31985
Protease inhibitor cocktail		Roche	11836170001
Ni-NTA Superflow		Qiagen	30450
Sigma adjuvant system		Sigma	S6322
Luciferase assay system		Promega	E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X)		Promega	E1531
Amicon Ultra – 15		Millipore	UFC901024
Microfluor 96-well plates		Thermo Scientific	7905
Ultra 384 luminometer		Tecan Systems