כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci
Summary
Biofilms נוצר על משטחי השן הם מורכבים מאוד חשוף מתמיד אתגרים סביבתיים מולד אקסוגניים, אשר לווסת את הארכיטקטורה שלהם, פיזיולוגיה transcriptome. פיתחנו ארגז הכלים לבחון את הרכב, ארגון מבניים ביטוי גנים של biofilms דרך הפה, אשר ניתן להתאים בתחומים אחרים של מחקר biofilm.
Abstract
Biofilms הם דינמיים מאוד, קהילות מאורגן ומובנה של תאים מיקרוביאליים לכוד במטריצה תאיים של צפיפות משתנה הרכב 1, 2. באופן כללי, biofilms להתפתח מצורף חיידקים הראשונית על משטח ואחריו היווצרות צבירי תאים (או microcolonies) ופיתוח ייצוב נוסף של microcolonies, אשר מתרחשים מטריצה תאיים מורכבים. רוב מטריצות biofilm exopolysaccharides הנמל (EPS), ו biofilms שיניים אינם יוצאים מן הכלל, במיוחד אלה הקשורים למחלת עששת, אשר מתווכת בעיקר על ידי mutans streptococci 3. EPS מסונתזים על ידי מיקרואורגניזמים (mutans ס, תורם מפתח) באמצעות אנזימים תאיים, כגון glucosyltransferases באמצעות סוכרוז בעיקר המצע 3.
מחקרים של biofilms נוצר על משטחי השן הם מאתגרת במיוחד בשל החשיפה המתמדת שלהם אתגרים סביבתיים הקשורים לתזונה מארח חיידקים יחסי הגומלין המורכבים המתרחשים בחלל הפה. הבנה טובה יותר של שינויים דינמיים של הארגון מבניים הרכב של מטריקס, פיזיולוגיה transcriptome / הפרופיל של proteome biofilm תאים בתגובה אלה אינטראקציות מורכבות היה לקדם את הידע הנוכחי של איך biofilms אוראלי לווסת pathogenicity. לכן, פיתחנו כלי אנליטי-box כדי להקל על ניתוח biofilm ברמות מבניים, ביוכימיים מולקולרית על ידי שילוב של טכניקות זמין בדרך כלל רומן עם תוכנת מחוייט לניתוח נתונים. סטנדרט אנליטי (מבחני colorimetric, RT-qPCR ו microarrays) וטכניקות הקרינה רומן (תיוג סימולטני של חיידקים EPS) שולבו עם תוכנה לניתוח נתונים ספציפיים לכתובת האופי המורכב של המחקר biofilm הפה.
הכלי תיבת מורכב 4 שלבים ברורים אך ביניהם (איור 1): 1) bioassays, 2) קלט נתונים גולמיים, 3) עיבוד נתונים 4) ניתוח נתונים. השתמשנו שלנו במבחנה biofilm מודל תנאים ניסויים ספציפיים כדי להדגים את התועלת והגמישות של תיבת הכלי. המודל biofilm היא פשוטה, לשעתקו מרובים משכפל ניסוי בודד ניתן לעשות בו זמנית 4, 5. יתר על כן, היא מאפשרת הערכה הזמני, הכללתם של מינים שונים של חיידקים 5 והערכה של ההשפעות של תנאים ניסויים שונים (למשל 6 טיפולים, השוואת מוטציות נוקאאוט מול הלחץ של ההורים 5; פחמימות זמינות 7). כאן אנו מתארים שני רכיבים ספציפיים של תיבת הכלי, כולל (i) תוכנה חדשה עבור microarray כריית נתונים / ארגון (MDV) וניתוח פלואורסצנציה הדמיה (DUOSTAT), וכן (ii) באתרה EPS-תיוג. אנו מספקים גם במקרה ניסיוני מראה כיצד הכלי תיבת יכולים לסייע בניתוח biofilms, נתוני הארגון, אינטגרציה ופרשנות.
Protocol
Discussion
במצגת זו, הראינו שני מרכיבים קריטיים של ארגז הכלים, אנליטי (EPS / חיידקים הדמיה microarray כריית נתונים / עיבוד), את הרבגוניות והתועלת של מבחני שונים משולבים במערכת. ברור, הכלי תיבת הקלו ניתוח מקיף (היחסי) בו זמנית של היבטים שונים של ביוכימיה biofilms, אדריכלות ביטוי גנים בתגובה תנ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ד"ר גארי שיה והרברט לי לפיתוח MDV. אנו מודים גם בני הזוג. סימון דוארטה, רמירו Murata, Jae-Gyu Jeon, Abranches ז'קלין, גב 'סטייסי Gregoire על תרומתו טכני ומדעי שלהם עבור רכיבי אנליטית של תיבת הכלי. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק מחקר USPHS DE018023 מהמכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | ||
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | ||
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | ||
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus, Tokyo, Japan |
Riferimenti
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Leme, P. a. e. s., Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. u. r. y. The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation–new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r., Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >., Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
