בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי
Summary
תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.
Abstract
תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי (עלי) כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים (CS), כדי ללמוד התגובות תא אפיתל חשיפה CS. פרוטוקול מורכב משלושה חלקים: בידוד של תאים אפיתל דרכי הנשימה של העכבר קנה הנשימה, את culturing של תאים אלה על הממשק אוויר נוזלי (עלי) כמו בתאי אפיתל הבדיל באופן מלא, ועל אספקת הזרם המרכזי CS מכויל תאים אלה בתרבית. מערכת התרבות עלי מאפשר התרבות של epithelia הנשימה בתנאים דומים יותר ההגדרה הפיזיולוגית שלהם מאשר מערכות תרבות נוזלי רגיל. המחקר של תגובות תאית ומולקולרית ריאות לחשיפה CS הוא מרכיב קריטי להבין את ההשפעה של זיהום אוויר איכות הסביבה על בריאות האדם. ממצאי המחקר בתחום זה עשוי בסופו של דבר לתרום להבנת האטיולוגיה של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ועוד מחלות הקשורות לטבק, המייצגים העיקריים לבעיות בריאות העולמי.
Protocol
Discussion
הפרוטוקול מתאר בידוד של תאים אפיתל העכבר קנה הנשימה מותאמת הפרוטוקולים של אתה et al., 1, ועוד 2-3 עם שינויים. כמו בכל isolations פרוטוקול המתאר התא, ההיבט הקריטי ביותר הוא להימנע זיהום חיידקי או פטרייתי פתוגנים על ידי שימוש בטכניקות aseptic קפדנית. הצעד השני הוא קר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Emeka Ifedigbo לקבלת סיוע טכני ד"ר Shivraj Tyagi עבור המומחיות יקר. כמו כן, אנו מודים מרכז NeuroDiscovery הרווארד לסיוע עם מיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי איגוד הלב האמריקני Predoctoral מענק 09PRE2250120 אל הילר לם, ו-NIH מענקים, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, הוענק AMK צ'וי.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
Riferimenti
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I. Cigarette smoke in research. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).
- Shapiro, S. D. Smoke gets in your cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).
