Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor
Summary
ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.
Abstract
Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) yaygın bir ana makromolekül bir ligand bağlama ile ilgili termodinamik parametreleri belirlemek için kullanılır. ITC konak / ligand etkileşimleri çalışmak için ortak spektroskopik yaklaşımlar üzerinde bazı avantajları vardır. Örneğin, serbest ya da iki bileşenden etkileşime girdiğinde emilir ısı doğrudan ölçülür ve herhangi bir eksojen gazetecilere gerektirmez. Bu nedenle bağlayıcı entalpi ve dernek sabiti (Ka), ITC verileri doğrudan elde edilen ve entropik katkısını hesaplamak için kullanılabilir. Ayrıca, izoterm şekli c-değeri ve katılan mekanistik model bağlıdır. C-değeri olarak tanımlanır c = n [P] TKA, [P] t protein konsantrasyonu ve n ev sahibi içinde ligand bağlayıcı sitelerinin sayısı. Pek çok durumda, belirli bir ligand için birden fazla bağlayıcı siteleri denk olmayan ve ITC, her bir bağlanma yeri için termodinamik bağlayıcı parametrelerinin karakterizasyonu sağlar. Ancak bu doğru bağlayıcı model gerektirir. Bu seçim, farklı modeller aynı deneysel verilere uygun eğer sorunlu olabilir. Biz daha önce bu sorunu c-değerleri çeşitli deneyler yaparak atlatılabilmişlerdir olabileceğini göstermiştir. C-değerleri farklı elde birden fazla izotermleri ayrı model aynı anda bir uyum vardır. Doğru model sonraki tüm değişken c veri kümesi arasında uyum iyiliği göre tespit edilir. Bu süreç, aminoglikozid direnci neden olan enzimi aminoglikozid N-6'-asetiltransferaz-Ii (AAC (6 ')-Ii) burada uygulanır. Bizim metodoloji herhangi bir sistem için geçerli olmakla birlikte, bu stratejinin gerekliliği daha iyi allostery veya cooperativity gösteren bir makromolekül-ligand sistemi ile gösterdi ve farklı bağlama modelleri aynı veri aslında aynı uyan. Bildiğimiz kadarıyla, piyasada bulunan böyle bir sistem vardır. AAC (6 ')-Ii, iki alt arasındaki cooperativity gösteren iki aktif siteleri içeren bir homo-dimer. Ancak tek bir c-değeri elde ITC verileri eşit derecede iyi iki-setleri-siteleri bağımsız model ve sıralı bir iki yerinde (kooperatif) modeli en az iki farklı modelleri uygun olabilir. Yukarıda açıklandığı gibi c-değeri değişen sayesinde, doğru bağlama modelini AAC (6 ')-Ii iki site sıralı bağlama modelini olduğunu kurulmuştur. Burada, biz ITC deneyler yaparken değişken c analizler için uygun veri setleri elde etmek için atılması gereken adımları açıklar.
Protocol
Discussion
Bu değişken c uydurma analitik bir kısmı daha önce ayrıntılı 10 tarif edilmiştir . İşte biz, bu yaklaşım için uygun değişken-c veri setleri toplama pratik yönlerini rapor. Bu protein ve ligand örnekleri aynı stok çözümleri çizilmiş olması esastır. Bu nedenle yeterli stok solüsyonu deneylerin tüm seriyi tamamlamak için başlangıçta hazır olduğunu önemlidir. Bu oranı AAC (6 ')-Ii sağlar ve AcCoA tüm deneyler arasında sürekli ve rastgele bir örnek-örnek bazında konsa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve bir CIHR eğitim bursu bursu (LF) tarafından desteklenmiştir. Biz AAC için Prof. Gerard D. Wright (McMaster Üniversitesi, Kanada) (6)-Ii ifade plazmid teşekkür ederiz.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
Riferimenti
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Biochimica. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
