Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones
Summary
Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.
Abstract
Todo el montaje análisis inmunohistoquímico para obtener imágenes de todo el sistema vascular es fundamental para la comprensión de los mecanismos celulares de la ramificación morfogénesis. Hemos desarrollado el modelo de la piel del miembro vasculatura para estudiar el desarrollo vascular en el que un pre-existentes primitivo plexo capilar se reorganiza en una red jerárquica ramificada vascular. Todo el montaje de microscopía confocal con el etiquetado múltiple permite a la imagen robusta de los vasos sanguíneos intactos, así como sus componentes celulares incluyendo las células endoteliales, pericitos y células de músculo liso, utilizando marcadores fluorescentes específicos. Los avances en este modelo las extremidades vasculatura la piel con los estudios genéticos han permitido comprender los mecanismos moleculares del desarrollo vascular y el patrón. La piel del miembro vasculatura modelo ha sido utilizado para estudiar cómo los nervios periféricos proporcionan un modelo espacial para la diferenciación y el patrón de las arterias. En este artículo se describe un protocolo de vídeo sencillo y robusto para teñir los vasos sanguíneos intactos con vascular anticuerpos específicos y anticuerpos fluorescentes secundaria, que es aplicable para vascularizado órganos embrionarios en los que son capaces de seguir el proceso de desarrollo vascular.
Protocol
Discussion
El sistema vascular es fundamental para el desarrollo de órganos durante la embriogénesis, así como para el mantenimiento de órganos y funciones de reproducción en los adultos, ya que proporciona suficiente oxígeno y nutrientes a los órganos. Red vascular adecuado es bien establecido, con procesos complejos y múltiples pasos por la angiogénesis en el que se reorganiza pre-existentes de la red capilar con estructuras muy ramificadas y jerárquica. A pesar de numerosos trabajos han demostrado que una variedad de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a K. Gill para obtener ayuda con la cría del ratón y el cuidado y la gestión de laboratorio. Gracias también a los miembros Mukoyama laboratorio para ayuda técnica. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Investigación Intramural del Instituto de Salud Naitonal.
Materials
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
| Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
| Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
| LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
| Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
| Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
| Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
| Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
| NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
| SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
| β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| 2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
| Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
| BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin．
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.
Riferimenti
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
