Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l'étude vasculaire morphogenèse de branchement de l'embryon
Summary
Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l'embryon.
Abstract
Whole-Mont analyse immunohistochimique pour l'imagerie du système vasculaire entier est essentielle pour la compréhension des mécanismes cellulaires de ramification morphogenèse. Nous avons développé le modèle de la vascularisation des membres de peau pour étudier le développement vasculaire dans lequel un pré-existante primitive plexus capillaire est réorganisée dans un réseau hiérarchiquement ramifiée vasculaire. Whole-Mont microscopie confocale avec étiquetage multiple permet pour l'imagerie des vaisseaux sanguins robustes intactes ainsi que leurs composants cellulaires dont les cellules endothéliales, péricytes et cellules musculaires lisses, en utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques. Les progrès dans ce modèle la vascularisation des membres peau avec des études génétiques ont permis d'améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du développement vasculaire et les motifs. Le modèle vascularisation des membres peau a été utilisée pour étudier comment les nerfs périphériques fournissent un modèle spatial pour la différenciation et la structuration des artères. Cet article décrit un protocole vidéo simple et robuste pour colorer les vaisseaux sanguins intacts avec des anticorps spécifiques et vasculaires anticorps secondaires fluorescents, qui est applicable pour les organes embryonnaires vascularisées où nous sommes en mesure de suivre le processus du développement vasculaire.
Protocol
Discussion
Le système vasculaire est crucial pour le développement des organes pendant l'embryogenèse ainsi que pour l'entretien des organes et des fonctions de reproduction chez les adultes, car il fournit suffisamment d'oxygène et de nutriments aux organes. Une bonne réseau vasculaire est bien établie avec des processus complexes et multi-étapes par l'angiogenèse dans lequel pré-existante du réseau capillaire est réorganisée avec des structures très ramifiées et hiérarchique. Bien que de nombreux t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions K. Gill de l'aide pour l'élevage de souris et de soins et de gestion de laboratoire. Merci également à Mukoyama membres du laboratoire de l'aide technique. Le financement a été fourni par le Programme de recherche intra-muros des Instituts Naitonal de la Santé.
Materials
Antibodies
Pan-endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| PECAM-1 | Armenian hamster (M) | Chemicon | MAB1398Z | 1:100 dilution#1 |
| PECAM-1 | Rat (M) | BD | 553369 | 1:300 dilution |
| VEGFR2 | Rat (M) | eBioscience | 14-5821-82 | 1:200 dilution |
| CD34 | Rat (M) | eBioscience | 13-0341 | 1:300 dilution |
| Collagen IV | Rabbit (P) | AbD Serotec | 2150-1470 | 1:300 dilution#2 |
Arterial endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| Neuropilin1 | Rabbit (P) | The Alex Kolodkin’s lab#3 | 1:3000 dilution | |
| Unc5H2 | Goat (P) | R&D | AF1006 | 1:200 dilution |
Venous endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| EphB4 | Goat (P) | R&D | AF446 | 1:100 dilution |
Lymphatic endothelial cell marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| LYVE-1#4 | Rabbit (P) | Abcam | ab14917 | 1:200 dilution |
| LYVE-1#4 | Rat (M) | MBL | D225-3 | 1:200 dilution |
| Prox-1 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5475 | 1:1000 dilution |
| Prox-1 | Goat (P) | R&D | AF2727 | 1:50 dilution |
| Neuropilin2 | Rabbit (P) | Cell Signaling | 3366 | 1;100 dilution |
| Podoplanin | Syrian hamster (M) | Hybridoma Bank | 8.1.1 | 1:200 dilution |
Smooth muscle cell/pericyte marker
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| αSMA-Cy3 | Mouse (M)#5 | Sigma | c-6198 | 1:500 dilution#6 |
| NG2 | Rabbit (P) | Chemicon | AB5320 | 1:200 dilution |
| SM22α | Rabbit (P) | Abcam | ab14106 | 1:200 dilution |
Antibodies forGFP reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| GFP | Rabbit (P) | Invitrogen | A11122 | 1:300 dilution |
| GFP | Rat (M) | Nacalai tesque | 04404-84 | 1:1000 dilution |
| GFP | Chick (P) | Chemicon | P42212 | 1:300 dilution |
Antibodies for LacZ reporter
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| β-gal | Rabbit (P) | MP Biomedical | 55976 | 1:5000 dilution |
| β-gal | Goat (P) | AbD Serotec | 4600-1409 | 1:500 dilution |
| β-gal | Chick (P) | Abcam | ab9361 | 1:200 dilution |
Antibodies for peripheral axon
| Antibody | Species | Company | Catalogue # | Working condition |
| 2H3 | Mouse (M)#7 | Hybridoma Bank | 2H3 | 1:200 dilution |
| Tuj1 | Mouse (M)#8 | Covance | MMS-435P | 1:500 dilution |
| Peripherin | Rabbit (P) | Chemicon | AB1530 | 1:1000 dilution |
Antibodies for migrating Schwann cells
| BFABP | Rabbit (P) | The Thomas Müller’s lab#9 | 1:3000 dilution |
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody
#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.
#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.
#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.
#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.
#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.
#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.
#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.
#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin．
#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.
Riferimenti
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
