Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Summary

Este artículo técnico describe un estándar occidental-blot procedimiento que utiliza la electroforesis disponibles en el mercado NuPAGE Mini-Gel sistema de Invitrogen.

Abstract

Western Blot (o inmunotransferencia) es un procedimiento estándar de laboratorio que permite a los investigadores a comprobar la expresión de una proteína, determinar la cantidad relativa de las proteínas presentes en diferentes muestras y analizar los resultados de los experimentos de co-inmunoprecipitación. En este método, una proteína diana se detecta con un anticuerpo primario específico en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto. Separación de proteínas en función del peso molecular se realiza mediante desnaturalización SDS-PAGE. Después de la transferencia a una membrana, la proteína de interés es determinada con un anticuerpo primario específico y detectado por quimioluminiscencia.

Desde su primera descripción, la técnica de western-blot ha sido objeto de varias mejoras, incluyendo pre-cast geles y equipos de fácil uso. En nuestro laboratorio, hemos optado por utilizar el sistema de electroforesis NuPAGE disponibles en el mercado de Invitrogen. Se trata de un pH neutro innovadoras, discontinuo SDS-PAGE, prefabricados de mini-gel del sistema. Este sistema presenta varias ventajas sobre la técnica tradicional de Laemmli, incluyendo: i) una vida útil más larga de los geles prefabricados que van desde 8 meses a 1 año, ii) un rango de separación amplia de pesos moleculares 1 a 400 kDa, dependiendo del tipo de de gel que se utiliza, y iii) una mayor versatilidad (rango de porcentaje de acrilamida, el tipo de gel, y la composición iónica del buffer de ejecución).

El procedimiento descrito en este artículo de vídeo utiliza el sistema Bis-Tris discontinua con 4-12% Bis-Tris gradiente de geles y MES funcionamiento de amortiguación, como una ilustración de cómo realizar un western blot, utilizando el sistema de electroforesis NuPAGE Invitrogen. En nuestro laboratorio, hemos obtenido buenos resultados y reproducible para diferentes aplicaciones bioquímicas utilizando este método occidental-Blot.

Protocol

Electroforesis en gel Nota técnica: Antes de comenzar el procedimiento, que las muestras de proteínas listo. Durante este primer paso, las proteínas de la muestra se separan según su peso molecular mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE). El NuPAGE ® tampón de muestra LDS cargado con dodecil sulfato de litio (LDS) mantiene polipéptidos en un estado desnaturalizado una vez que la muestra de proteína s…

Discussion

El procedimiento que aquí se presenta utiliza un gel de Bis-Tris con MES funcionamiento de amortiguación como un ejemplo de la desnaturalización PAGE utilizando el sistema de electroforesis Invitrogen NuPAGE Novex. Además, este sistema de gel prefabricados permite la separación de proteínas en desnaturalización o no desnaturalización condiciones, así como se adapta a una amplia gama de pesos moleculares (1 a 200 kDa para los geles de Bis-Tris de 36 a 400 kDa para el Tris- geles de acetato). Dependiendo de su experiencia, usted pued…