Bröst Transplantation av stromaceller och celler carcinoma in C57BL/6J Möss
Summary
I den här rapporten visar vi ett system för att isolera och odla celler givare från mus juvret och orthotopically transplantera dessa celler i mottagarländerna möss att analysera stromaceller: epiteliala interaktioner under juvertumör utveckling.
Abstract
Inverkan av stromaceller, bland andra fibroblaster på bröst tumörprogression är väl dokumenterade med hjälp av musmodeller, särskilt genom transplantation av stromaceller och epitelceller i mjölkkörtlar hos möss. Aktuella transplantation modeller innebär ofta användning av nedsatt immunförsvar möss på grund av olika genetiska bakgrunder stromaceller och epitelceller. Extracellulär matriser används ofta för att bädda in två olika celltyper för konsekvent cell-cell interaktioner, men omfattar användning av Matrigel eller råtta svans kollagen, som är immunogena substrat. Avsaknaden av fungerande T-celler från immunsupprimerade möss förhindrar korrekt bedömning av stromaceller om juvertumör progression in vivo, med viktiga konsekvenser för läkemedelsutveckling och effekt. Dessutom nedsatt immunförsvar möss är dyra, svåra att föda upp och kräver särskild omsorg villkor. För att övervinna dessa hinder, har vi utvecklat ett förhållningssätt till orthotopically transplantation stromaceller celler och epitelceller i möss med samma genetiska bakgrunden för att framkalla konsekvent tumörbildning. Detta system innebär avverkning normalt, cancer förknippas fibroblaster, PyVmT bröst celler cancer och kollagen från givare C57BL/6J möss. Cellerna är sedan inbäddade i kollagen och transplanteras i inguinal mjölkkörtlar hos kvinnliga C57BL/6J möss. Transplantation av PyVmT celler ensam bilda palpabla tumörer 30-40 dagar efter transplantation. Endpoint analys på 60 dagar visar att co-transplantation med fibroblaster ökar juvertumör tillväxt jämfört med PyVmT celler transplanterade ensam. Medan celler och matris från C57BL/6J möss användes i dessa studier, kan isolering av celler och matrix och transplantation tillvägagångssätt användas mot möss med olika genetisk bakgrund visar mångsidighet. Sammanfattningsvis kan detta system användas för att undersöka molekylära interaktioner mellan stromaceller och epitelceller, och övervinner kritiska begränsningar hos immunsupprimerade musmodeller.
Protocol
Discussion
Den funktionella bidrag fibroblaster i tumörprogression har visats genom transplantation modeller, där cancer förknippas fibroblaster samarbete transplanteras med godartade bröst epitelceller leder till ökad tumörtillväxt och invasiv 5. Konventionella transplantation metoder har inblandade användning av SCID eller nakna möss att samarbeta transplantation stromaceller och epitelceller från olika genetiska mus bakgrunder eller olika arter. Nedsatt immunförsvar möss saknar fungerande T-celler, som sp…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt finansieras genom av NIH / NCI licensnummer R00 CA127357 och University of Kansas Cancer Center Endowment.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| C57BL/6N mice | Harlan | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson laboratories | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | MT-30-001 | |
| amphotericin | fisher | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma AldrichC0130-50 | ||
| hyalronidase | Sigma Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Biorad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher | A406P 4 | |
| betadine | fisher | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher | 12031-07 |
Riferimenti
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Medina, D., Kittrell, F., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O’Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
