Молочные трансплантации стромальных клеток и клетки карциномы у мышей C57BL/6J
Summary
В этом докладе, мы демонстрируем системы, чтобы изолировать и культуры донорских клеток от мышей молочной железы, и orthotopically трансплантации этих клеток мышам-получателей, чтобы проанализировать стромальных: эпителиальных взаимодействий в молочных развития опухоли.
Abstract
Влиянием стромальных клеток, включая фибробласты на молочные прогрессии опухоли были хорошо документированы с помощью мыши моделей, в частности, путем трансплантации стромальных клеток и клеток эпителия молочной железы мышей. Современные модели трансплантации часто связаны с использованием иммунитетом мышей из-за различных генетических особенностей, характерных для клетки стромы и эпителиальных клеток. Внеклеточной матрицы часто используется для внедрения двух различных типов клеток для последовательного межклеточных взаимодействий, но связаны с использованием Матригель или крысы хвост коллагена, которые иммуногенных субстратов. Отсутствие функциональной Т-клеток от мышей иммунитетом предотвращает точную оценку стромальных клеток опухоли молочной железы на прогрессию в живом организме, что имеет важные последствия на развитие и эффективность лекарств. Более того, ослабленным иммунитетом мышей являются дорогостоящими, трудно породы и требуют особых условий ухода. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы разработали подход к orthotopically трансплантации стромальных клеток и эпителиальных клеток мышам с того же генетического фона, чтобы вызвать последовательное формирование опухоли. Эта система включает в себя уборка нормальная, рак связаны фибробластов, PyVmT клетки молочной железы рак и коллаген-доноров мышам C57BL/6J. Затем клетки встроенных в коллагене и пересадить в паховых молочных желез самок мышей C57BL/6J. Трансплантация PyVmT клетки только форма ощутимой опухоли 30-40 дней после пересадки. Endpoint анализ на 60 дней показывает, что совместное трансплантации фибробластов усиливает рост опухоли молочной сравнению с PyVmT клетки трансплантировали в одиночку. Хотя клетки и матрицы от мышей C57BL/6J были использованы в этих исследованиях, изоляции клеток и матричных и трансплантации подход может быть применен к мышей от различных генетических фоны демонстрируя универсальность. Таким образом, эта система может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий между клетками стромы и эпителиальных клеток, и преодолевает ограничения критических с ослабленным иммунитетом модели мыши.
Protocol
Discussion
Функциональный вклад фибробластов в опухолевой прогрессии была продемонстрирована на основе моделей трансплантации, в которых рак связаны фибробластов совместно с пересаженной доброкачественные эпителиальные клетки результатов в увеличении роста опухоли и инвазивности 5. Тр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был профинансирован через НИЗ / NCI номер гранта R00 CA127357 и Канзасского университета онкологический центр фонда.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| C57BL/6N mice | Harlan | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson laboratories | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | MT-30-001 | |
| amphotericin | fisher | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma AldrichC0130-50 | ||
| hyalronidase | Sigma Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Biorad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher | A406P 4 | |
| betadine | fisher | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher | 12031-07 |
Riferimenti
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Medina, D., Kittrell, F., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O’Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
