C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli
Summary
Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.
Abstract
Stromal hücreler, fibroblastlar meme tümör progresyonu dahil olmak üzere etkisi özellikle farelerde meme bezi stromal hücreleri ve epitel hücrelerinin nakli yoluyla, fare modellerinin kullanımı ile belgelenmiştir. Şu nakli modelleri genellikle stromal hücreler ve epitel hücrelerinin farklı genetik geçmişleri nedeniyle immün sistemi baskılanmış farelerde içerir. Ekstrasellüler matrisler genelde tutarlı hücre-hücre etkileşimleri için iki farklı hücre tipleri gömmek, ancak Matrigel veya sıçan kuyruğu kollajen, immunojenik substratlar kullanımı dahil etmek için kullanılır. Immünkompromize farelerden elde edilen fonksiyonel T hücre eksikliği, ilaç geliştirme ve etkinliği üzerinde önemli etkileri, in vivo tümör progresyonu meme stromal hücreler doğru bir değerlendirme önler . Ayrıca, immün sistemi baskılanmış farelere, yüksek maliyetli sabit, özel bakım koşullarında ırk ve gerektirir. Bu engelleri aşmak için, biz orthotopically tutarlı tümör oluşumuna neden aynı genetik arka plan, stromal hücre ve epitel hücreleri farelere nakli için bir yaklaşım geliştirdik. Bu sistem, donör C57BL/6J fareler, normal karsinom ilişkili fibroblastlar, PyVmT meme kanseri hücreleri ve kollajen hasat içerir. Hücreler daha sonra kolajen gömülü ve kasık, dişi C57BL/6J farelerin meme bezleri nakledilen. PyVmT hücreleri tek başına Transplantasyon palpe edilebilir tümörler 30-40 gün transplantasyon sonrası oluşturur. 60 gün Son Nokta analizi fibroblastlar ile birlikte transplantasyon yalnız nakledilen PyVmT hücreleri ile karşılaştırıldığında meme tümör büyümesini artırır gösterir. C57BL/6J farelerin hücreleri ve matriks bu çalışmalarda kullanılan iken, hücre ve matriks izolasyonu ve transplantasyonu yaklaşım çok yönlülük gösteren farklı genetik kökenden farelere karşı uygulanabilir. Özetle, bu sistem stromal hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki moleküler etkileşimler araştırmak için kullanılan olabilir ve immün sistemi baskılanmış fare modellerinde kritik kısıtlamaların üstesinden gelmektedir.
Protocol
Discussion
Tümör progresyonu fibroblastların fonksiyonel katkı karsinom ilişkili fibroblastlar, artan tümör büyümesi ve invazivlik 5 iyi huylu meme epitel hücreleri ile birlikte nakledilen hangi transplantasyon modelleri ile kanıtlanmıştır . Konvansiyonel nakli yaklaşımlar, farklı genetik fare geçmişleri ya da farklı türlerin ortak nakli stromal ve epitelyal hücreleri SCID veya çıplak farelerin kullanılması yer var. Immün sistemi baskılanmış farelerde tümör spesifik antijen ve tümör hü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje üzerine NIH / NCI hibe sayısı R00 CA127357 ve Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi Endowment tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| C57BL/6N mice | Harlan | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson laboratories | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | MT-30-001 | |
| amphotericin | fisher | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma AldrichC0130-50 | ||
| hyalronidase | Sigma Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Biorad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher | A406P 4 | |
| betadine | fisher | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher | 12031-07 |
Riferimenti
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Medina, D., Kittrell, F., Asch, B. B., Ip, M. M. . Methods in Mammary Gland Biology. , (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O’Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
