Transmembrana Domain oligomerisering Benägenhet bestäms av ToxR analys
Summary
Ett effektivt förfarande för att bedöma oligomerisering benägenhet enpassage transmembrana domäner (TMDS) beskrivs. Chimär proteiner bestående av TMD smält till ToxR uttrycks i en E. coli-reporter stam. TMD-inducerad oligomerisering orsaker dimerization av ToxR, aktivering av transkription och produktion av reportern protein-galaktosidas.
Abstract
Den onyanserade bild av domäner protein transmembrana endast som ankare i fosfolipid bilayers sedan länge motbevisat. I många fall membran-spänner proteiner har utvecklats mycket sofistikerade verkningsmekanismer. 1-3 Ett sätt på vilket membranproteiner kan modulera deras strukturer och funktioner är av direkta och specifika kontakt hydrofoba helixar, som utgör strukturerade transmembranösa oligomerer. 4,5 Mycket senare Arbetet har fokuserat på distribution av aminosyror företrädesvis finns i membranet miljö jämfört med vattenlösning och de olika krafter intermolekylära som driver protein föreningen. 6,7 dock studier av molekylär igenkänning vid transmembrana domän proteiner fortfarande släpar efter de vattenlösliga regioner. Ett stort hinder kvarstår: Trots den märkliga specificitet och affinitet som transmembrane oligomerisering kan uppnå, är 8 direkt mätning av deras förening utmanande. Traditionella metoder tillämpas för att studera integrerade membranprotein funktion kan hämmas av den inneboende olöslighet av de sekvenser som granskas. Biofysiska insikter från att studera syntetiska peptider som representerar transmembrana domäner kan ge värdefull strukturell insikt. Men den biologiska relevansen av rengöringsmedel micellär eller liposomer som används i dessa studier för att efterlikna cellmembran ofta ifrågasatts, gör peptider anta en infödd-liknande struktur under dessa förhållanden och inte deras funktionella beteendet verkligen återspeglar verkningsmekanismen inom en infödd membran ? För att studera interaktioner mellan transmembrana sekvenser i naturliga fosfolipid bilayers utvecklade Langosch labbet ToxR transkriptionell reporter analyser. 9 det transmembrana domän av intresse uttrycks som en chimär protein med maltos bindande protein för plats till periplasm och ToxR att lämna en rapport av nivån på oligomerisering (Figur 1).
Under det senaste decenniet har flera andra grupper (t.ex. Engelman, DeGrado, Shai) optimeras ytterligare och tillämpat denna analys ToxR reporter. 10-13 De olika ToxR-analyser har blivit en guldmyntfot att testa protein-protein interaktioner i cellmembranen. Vi visar här ett typiskt experimentell verksamhet bedrivs i vårt laboratorium som i första hand följer protokoll som utvecklats av Langosch. Denna allmängiltig metod är användbar för analys av transmembrana domän själv-förening i E. coli, där β-galaktosidas produktionen används för att bedöma TMD oligomerisering benägenhet. Vid TMD-inducerad dimerization, binder ToxR till ctx promotor orsakar uppreglering av LacZ genen för β-galaktosidas. En kolorimetrisk avläsning erhålls genom tillsats av ONPG till lyzed celler. Hydrolytisk klyvning av ONPG av β-galaktosidas resultat i produktionen av ljusabsorberande arter o-nitrophenolate (ONP) (Figur 2).
Protocol
Discussion
Den ToxR transkriptionell reporter-analysen är ett lättvindigt sätt att identifiera transmembrana sekvenser med potential att oligomerize. Eftersom interaktioner sker inom den bakteriella inre membranet, kringgår denna analys av frågor i samband med giltigheten av att studera system i membran-mimetiska miljöer. Med tanke på att kloning av flera TMDS i en enda plasmid lätt kan ske parallellt och hela analysen kan utföras i 96-brunnar format, kan detta test användas för hög genomströmning analys av stora män…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar National Institutes of Health (1R21CA138373 och Stand Up till Cancer (SU2C) för finansiellt stöd i detta arbete. HY är tacksam för 2009 Elion Award från American Association of Cancer Research, en Kimmel Scholar Award från Sidney Kimmel Stiftelsen för Cancer Research (SKF-08-101) och National Science Foundation fakulteten tidiga karriär Award (NSF0954819).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | Teknova | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Chemicals | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercaptoethanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercaptoethanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | NEB | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWRI | 89032-204 | |
| Shaking incubator | FormaScientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
