Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri
Summary
Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.
Abstract
Tip 1 diyabet (T1D) T hücre aracılı otoimmün hastalık. Patogenezinde sırasında, hastaların insülin üretimi kayıp olarak T hücreleri tarafından pankreas beta hücrelerinin yıkımını muhtemelen bu sonuç, giderek daha insulinopenic hale gelir. T1D gelişimi sırasında beta hücre ölüm mekanizmaları anlamak, bu hastalık için etkili bir çare üretmek için anlayışlar sağlayacaktır. Hücre aracılı lenfositotoksisite (KML) testlerin tarihsel hedef hücreleri etiket radyonüklid Krom 51 (51 Cr) kullanılır. Bu hedefler daha sonra efektör hücreleri maruz kalan ve 51 Cr hedef hücrelerden serbest bırakılması lenfosit aracılı hücre ölümü bir göstergesi olarak okunur . 51 Cr azalmış serbest hücre ölümü sonucu inhibitörleri.
Efektör hücreler olarak, CD8 aktive otoreaktif klonal nüfus + AI4 T hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri için bir fare stok transgenik izole Sitotoksik T lenfositler (CTL) kullanılır. Aktif AI4 T hücreleri 16 saat boyunca 51 Cr etiketli hedef NIT hücreleri birlikte kültür, serbest bırakılması 51 Cr belirli lizis hesaplamak için kaydedildi
Mitokondri, enerji üretimi, sinyal transdüksiyon düzenlenmesi ve apoptosis gibi birçok önemli fizyolojik olaylar, katılırlar. T1D gelişimi sırasında beta hücre mitokondrial fonksiyonel değişiklikler çalışma, bir araştırma roman alanıdır. Mitokondriyal membran potansiyeli boya tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) ve konfokal mikroskobik canlı hücre görüntüleme kullanarak, beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli zaman içinde izlenmektedir. Görüntüleme çalışmaları için, efektör AI4 T hücreleri floresan nükleer boyanma boya Picogreen etiketli. NIT-1 ve T hücreleri odacıklı coverglass ortak kültür ve canlı bir hücre odası ile donatılmış mikroskop aşamasında üzerine monte edilmiş, 37 kontrol edildi ° C,% 5 CO 2 ve nemlendirilmelidir. Bu deneyler sırasında görüntüleri her küme her 3 dakikada bir 400 dakika alındı.
400 dakika boyunca, biz AI4 T hücreleri bağlı NIT-1 hücre kümeleri mitokondrial membran potansiyeli dağılımı görülmektedir. NIT-1 hücreleri MHC ile birlikte kültüre edildi eşzamanlı kontrol deneyde yanlış uyumlu insan lenfosit Jurkat hücreleri, mitokondriyal membran potansiyeli bozulmadan kalabilmiş. Bu teknik, sitotoksik lenfosit, sitokinler, veya diğer sitotoksik reaktifler saldırı altında hücreleri mitokondrial membran potansiyeli gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Sitotoksik T hücre aracılı beta hücre ölümü T1D 5 ana patofizyolojisi. 51 Cr sürümü kullanarak KML testleri bize efektör-hedef yanıt 6 derecesini incelemek için izin verir. Ancak, ayrıntılı bir süreç ve T hücre-aracılı beta hücre ölümü yolları hala tam olarak anlaşılmış değildir. Mitokondri, beta hücre fonksiyonu ve ölüm 7 için kritik olduğundan, görsel KML sırasında mitokondrial değişiklikler üzerine odaklanmıştır . Mitokondrial za…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın yanı sıra, National Institutes of Health DK074656 ve AI56374 (CEM) hibe Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cr-51 | Perkin Elmer | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass | Fisher | 14-958-A | |
| Gamma Counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT+ | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | The Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
Riferimenti
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
