Простой и эффективный способ изолировать Макрофаги из смешанного первичных культурах клеток взрослого организма Печень

Summary

Новый метод получения макрофагов от первичной культуры клеток печени крыс описана. Этот метод использует распространения макрофагов в культуре, а затем встряхивания колб культуры и очистки селективным привязанность к пластиковой посуды. Этот метод эффективно обеспечивает печени макрофаги без сложного оборудования и навыков.

Abstract

Купфера клетки печени конкретного жителя и макрофаги играют важную роль в физиологических и патологических функций печени ^1-3. Хотя методы изоляции печени макрофаги были хорошо описаны ^4-6, большинство из этих методов требуют сложного оборудования, таких как центробежные прибор для отмучивания и технических навыков. Здесь мы предлагаем новый метод для получения печени макрофаги в достаточном количестве и чистоты от смешанных первичных культурах клеток взрослого организма печень крысы, как схематически показано на рисунке 1.

После диссоциации клеток печени двухступенчатый метод перфузии ^7,8, фракция в основном состоит из паренхимы гепатоцитов готовится и посеяны в культуре ткани T75 колбы с культурой среды, состоящей из DMEM и 10% FCS.Parenchymal гепатоциты теряют морфологию клеток эпителия в течение нескольких дней в культуре, вырождаются и превращаются в фибробластоподобные клетки (рис. 2). Как культура выручки, около 6-й день, фазовый контраст ярких, круглых макрофагами, как клетки начинают размножаться на фибробластов ячеек листа (рис. 2). Рост макрофагами, как клетки продолжают и достигают максимального уровня примерно 12-й день, покрывая ячейки листа, на колбе поверхности. По встряхивания колб культуры, макрофаги легко приостановлено в культуральной среде. Последующая передача и короткий инкубационный в пластиковых блюд в результате селективной адгезии макрофагов (рис. 3), где также других загрязняющих клетки остаются приостановлены. После нескольких полоскания с PBS, прилагается макрофагов собраны. Более 10 ^{6 клеток} могут быть собраны несколько раз из той же ткани T75 культуры колбу в возрасте двух-трех интервалов день в течение более двух недель (рис. 3). Чистоты выделенных макрофаги 95 до 99%, как оценивали с помощью проточной цитометрии или иммуноцитохимии с крысой макрофаг-специфического антигена (рис. 4). изолированных клеток показывают активный фагоцитоз polystylene шариков (рис. 5), пролиферативный ответ на рекомбинантный ГМ-КСФ, секрецию воспалительных / противовоспалительных цитокинов при стимуляции ЛПС, и формирование многоядерные гигантские клетки ^9.

В заключение, мы предлагаем простой и эффективный метод получения печени макрофаги в достаточном количестве и чистота без сложного оборудования и skills.This метод может быть применим и к другим видам млекопитающих.

Protocol

1. Перфузии печени Обезболить взрослого самца Sprague-Dawley крыс (от 10 до 15 недель от роду, весом 150-200 г) путем внутрибрюшинного введения натрия пентобарбитал решение (50 мг натрия пентобарбитал / кг массы тела). Место животное в кастрюле из нержавеющей и спрей 70% этанола на ее живот и грудную клетку. Сделайте небольшой надрез и снимите кожу. Открытый живот разрезать ножницами. Подтвердить расположение воротной вены, проходит хирургическое нить под воротной вены и свободно комок. Кламп дистальной части нижней полой вены и брыжеечные вены, чтобы предотвратить рефлюкс крови в печени. Открытое грудной полости за счет сокращения диафрагмы с ножницами, и подвергать сердце. Вставьте пластиковый катетер (2 мм в диаметре) в воротной вене и затяните нить прочно вокруг катетера. Подключите катетер, чтобы перфузии системы, которая загружается с моющим раствором (Са 2 +-Mg 2 + бесплатный HBSS, содержащего 0,5 мМ EGTA, 10 HEPES мМ и 4,2 мМ NaHCO 3, рН 7,2) нагретого при температуре 37 ° C. Начало перфузии на месте со скоростью 10 мл / мин. В то же время, сделать разрез в правой стене атриума. Продолжить перфузии в течение 10 мин. Коммутатор перфузии решение решение коллагеназы [HBSS содержащей 10 мМ HEPES и 4,2 мм NaHCO 3 дополнен коллагеназы I типа (0,05%) и ингибитор трипсина (50 мкг / мл); рН 7,5], и заливать в течение 10 – 20 мин при скорости 10 мл / мин, пока печень слегка набухает и показывает знак для распада структуры печени под серозной оболочки. 2. Подготовка паренхимы гепатоцитов богатых клеточной фракции Снять и тщательно передачи печени в стерильных стакан, содержащий 25 мл коллагеназы решение. Фарш на мелкие кусочки ножницами. Добавить 75 мл холодной MEM в полученную суспензию клеток. После нежного пипетки, фильтрата через ячейки сетчатого фильтра (100 мкм) для удаления соединительных тканей и непереваренных фрагментов ткани. Передача фильтрата в 50 мл конические пробирки и центрифуги при 50 мкг в течение 1 мин при 4 ° С (тормоз выключен). Тщательно отказаться супернатант. Ресуспендируют гранул с холодной MEM. Повторите 2.4) в три раза. 3. Смешанное первичной культуры клеток печени Приостановить клеток, полученных в 2.5) в питательной среде в составе DMEM, содержащей 10% тепла инактивированной ФТС, дополненные 100 мкМ β-меркаптоэтанола, 10 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ед / мл пенициллина, и семя в 9:55 культуре ткани колбы (площадь поверхности: 75 см 2) с плотностью 6,7 · 10 4 клеток / см 2 (5 х 10 6 клеток / колбу / 12 -15 мл среды). Инкубируйте культуру flasksat 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 – 95% воздуха. Замените среду роста каждые 2 до 3 дней интервалами. 4. Селективного выделения Макрофаги Через 12 дней культуры, макрофаги распространяются на клетку листа. Эти клетки приостановлены взаимные сотрясение культуры колбах при 80 – 120 ударов в минуту в течение 30 мин при 37 ° C. Передача культуральной среде в 100 мм без тканевой культуры пластика блюд. Бассейн среду из двух колб T75 в одну пластиковую тарелку. Refill культуры колбах со средой роста и возвращения их в инкубатор. Инкубируйте пластиковой посуды в течение 30 мин при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 – 95% воздуха. Макрофаги легко прикрепить к не-культуре ткани пластика блюда в соответствии с настоящим процессе инкубации, тогда как другие загрязняющие клетки нет. Аспирируйте среднего и осторожно промыть пластиковой посуды с PBS. Повторите это действие три раза. Добавьте 1 мл раствора TrypLE Экспресс в блюдо, и инкубировать 10 минут при температуре 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 – 95% воздуха. Добавить 9 мл ростовой среды. Аккуратно соскоблите прилагается макрофагах ячейки скребком. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку и центрифуги при 180 мкг в течение 5 мин при 25 ° C (тормоз). Удалите супернатант и добавьте 1 мл ростовой среды. Распадаются на отдельные клетки путем энергичного пипетирования. Перечислить количество клеток по гемоцитометра счета. Изоляция шаги можно повторить с той же колбы культуры в возрасте двух-трех интервалов день в течение более двух недель. Изолированные макрофаги могут быть культивировали в питательной среде описанные в пункте 3.1. 5. Представитель Результаты Примером смешанной первичной культуре клеток взрослого печени крыс показано на рисунке 2. Паренхимы гепатоциты теряют эпителиальных морфологию клеток в течение нескольких дней в культуре, вырождаются и превращаются в фибробластоподобных клеток.Затем, около 6-й день до 12, фазового контраста-яркие, круглые макрофаг-подобных клеток vigourouly распространяться на фибробластов ячеек листа. По встряхивания колб культуры, макрофаги легко приостановлено в культуральной среде, и последующей передачи и инкубации в пластиковой посуды в результате селективной адгезии макрофагов (рис. 3). Макрофаг-подобные клетки могут быть собраны уже в 8-й день, а число достигло максимального уровня в те дни, от 12 до 14. Более 10 6 клеток можно получить из колбы T75 культуры неоднократно на 2 до 3-дневными интервалами в течение более двух недель, что позволяет полный выход клеток на колбу 10 7 в T75 культуры колбу (рис. 3). Чистота изолированных макрофаги 95 до 99%, как оценивается flowcytometry или иммуноцитохимии с крысой макрофаг-специфические антитела, такие, как ED-1 (рис. 4), ЭД-3, ОХ-41 (рисунок 4) и Iba1 9. изолированных клеток показаны типичные характеристики макрофагов, такие как активный фагоцитоз polystylene шариков (рис. 5), пролиферативный ответ на рекомбинантный ГМ-КСФ, секрецию воспалительных / противовоспалительных цитокинов при стимуляции ЛПС, и формирование многоядерные гигантские клетки 9. Рисунок 1. Схему для селективного выделения и очистки макрофаг-подобных клеток из смешанных первичной культуры клеток печени крыс. Рисунок 2. Первичные культуры клеток печени крысы и пролиферации макрофагов-подобных клеток. Стрелка указывает на многоядерные гигантские ячейки. Шкала бар = 100 мкм. Перепечатано из журнала иммунологические методы, Vol.360, 47-55 (2010) 9 с разрешения Elsevier. Рисунок 3. Селективная изоляция макрофаг-подобных клеток путем встряхивания и способа крепления. Клетки были приостановлены в культуральной среде путем встряхивания колб, впоследствии были переведены в не-культуры ткани класса блюда пластика, и инкубировали при 37 ° C. Уже через 10 минут после покрытия, макрофагами, как клетки прикреплены к поверхности посуды, в то время как другие загрязняющие фибробластов клетки оставались приостановлено. После промывки PBS, высокой степени очистки макрофагов населения было получено. Эти клетки получили типичный морфология макрофагов через 40 мин культуры и делящихся клеток часто наблюдается (стрелки). Последующие изменения в ячейке номера оправился от колбы в разные периоды культуры показано на рисунке. Значения среднего ± стандартное отклонение от трех до пяти колб. Эксперименты были повторены три раза, и данные обозначены разными символами. Шкала бар = 100 мкм. Перепечатано из журнала иммунологические методы, Vol.360, 47-55 (2010) 9 с разрешения Elsevier. Рисунок 4. Иммуноцитохимическая окрашивание макрофаг-подобных клеток с моноклональными антителами против крыс макрофагов. Рисунок 5. Фагоцитоз FITC-меченого микрошарики по макрофаг-подобных клеток.

Discussion

Здесь мы приводим простой и эффективный метод получения макрофагов от смешанных первичных культурах клеток взрослого печени крысы. Наш метод основан в первую очередь на роман пролиферативную активность макрофагов в смешанной культуре клеток печени крыс, а затем последующего выделения и очистки этих клеток на основе их биологических характеристик, как макрофаги ^9. Это может быть возможным макрофагов распространение в смешанной первичной культуре клеток взрослого организма печень, возможно, происходит от Купфера или связанных с ними клеток, загрязненных в паренхиматозных фракция гепатоцитов. Макрофаги, возможно, ответил на конкретные экологические изменения, вызванные сменой паренхимы печени ¹⁰ и других фибробластов клеток в смешанных первичных культур.

В заключение, наш метод обеспечивает изоляцию макрофагов-подобных клеток в достаточном количестве и чистоты от первичной культуре печени крыс cellswithout использованием современного оборудования и технических навыков. Кроме того, изоляция процедуру можно повторить с той же колбе культуры на протяжении более двух недель. Этот метод может быть применим и к другим видам млекопитающих.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Sodium pentobarbital solution	Kyoritsu Seiyaku	Somnopentyl Injection
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14185-052
Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
Collagenase	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	032-10534	Cell dissociation grade (Lot check needed)
Trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T-9128
Eagle’s minimum essential medium (MEM)	Sigma-Aldrich	M-4655
Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)	Sigma-Aldrich	D-6459	High glucose-type
Fetal calf serum (FCS)	HyClone	SH30070.03	Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed)
TrypLE Express	Invitrogen	12605
Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	14190	Ca2+-Mg2+ free
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-7522	Stock: 100 mM in distilled water
Insulin	Sigma-Aldrich	I-5500	Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl
Penicillin/ streptomycin	Invitrogen	15070
Cell strainer	BD Biosciences	352360	Mesh size: 100 μm
Tissue culture flask	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-21250	Surface area: 75 cm2
Non-tissue culture plastic dishes	BD Biosciences	351005
Cell scraper	Corning Inc.	3010
Reciprocal shaker	TAITEC	NR-1