시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em
Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 시토크롬의 직접적인 세포질 microinjection을 설명<em> C</em섬유아 세포 및 기본 교감 신경으로> 단백질. 이 기술은 시토크롬의 도입을 허용<em> C</em세포 및 일일 시토크롬의 릴리스의 세포질에> 단백질<em> C</em> mitochondria에서, 이것은 apoptosis 동안 발생합니다.
Abstract
Apoptosis 또는 프로그램된 세포 죽음은 세포가 1 죽게하는 보존과 높은 규제 경로입니다. 세포가 세포 독성 스트레스의 다양한 발생하는 경우 Apoptosis가 발생하실 수 있습니다. 이러한 모욕 궁극적으로 mitochondrial intermembrane 공간에서 세포질 2 시토크롬 C의 릴리스의 원인이 신호 폭포를 시작합니다. mitochondria에서 시토크롬 C의 릴리스는 caspases, 궁극적으로 3-4 세포 죽음을 실행할 핵심 세포 프로 테아제의 급속한 활성화를 유발하는 핵심 이벤트입니다.
apoptosis의 경로는 mitochondria 5 시토크롬 C 릴리스의 상류와 하류 지점에 규제입니다. caspase 활성화의 포스트 mitochondrial 규제를 공부하기 위해 많은 조사가 holocytochrome C (헴 연결된) 전지 6-9로 단백질의 직접적인 세포질 microinjection로 설정되어 있습니다. 시토크롬 C는 일반적으로 헴 그룹의 첨부 파일은 10-11 apoptosis 활성화하도록하는 데 필요한 어디 mitochondria에 언어입니다. 따라서 직접 caspases를 활성화하기 위해서는 cDNA 구조에서 시토크롬 C의 표현이 mitochondrial 타겟팅 및 헴 첨부집니다 동안 그것 cytosolic caspases에서 분리된 것입니다 때문에 holocytochrome C 단백질 대신 자사의 cDNA를 삽입하는 것이 필요합니다. 따라서 정화 헴 연결된 시토크롬 C 단백질의 직접 cytosolic microinjection은 셀룰러 및 mitochondrial 손상을 독성이 모욕을 사용하지 않고 mitochondrial 시토크롬 C 자료 및 apoptosis를 모방하는 유용한 도구입니다.
이 문서에서는, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포의 (MEFs)와 예에서 볼 수 있듯이 기본 교감 신경을 사용하여 세포로 시토크롬 C 단백질의 microinjection을위한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 apoptosis의 수사 시토크롬 C의 주입에 초점을 맞춘 반면, 여기에 나와있는 기술도 쉽게 관심을 다른 단백질의 microinjection에 대해 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
직접 세포의 세포질에 시토크롬 C의 microinjection은 apoptosis의 포스트 mitochondrial 규제 연구 수있는 독특하고 강력한 도구입니다. 중요한 것은,이 기술은 셀룰러 또는 mitochondrial 손상을 에이전트를 사용하지 않고 mitochondria의 apoptosis 하류의 직접적인 활성화를 위해 수 있습니다.
이 프로토콜은 apoptosis에 대한 연구 시토크롬 C의 microinjection에 초점을 맞춘 반면, 여기?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 MD에 NIH 부여 NS042197에 의해 지원되었다. AJK는 보조금 T32GM008719와 F30NS068006 지원했다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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