تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em
Summary
في هذا البروتوكول ، ونحن تصف microinjection مباشرة من هيولي السيتوكروم<em> ج</em> البروتين في الخلايا الليفية والخلايا العصبية المتعاطفة الابتدائي. هذه التقنية تتيح لإدخال السيتوكروم<em> ج</em> البروتين في الخلايا والسيتوبلازم يحاكي الافراج عن السيتوكروم<em> ج</em> من الميتوكوندريا ، والذي يحدث أثناء موت الخلايا المبرمج.
Abstract
موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلية المبرمج ، هو مسار الحفظ ودرجة عالية من التنظيم من قبل الخلايا التي تموت 1. يمكن أن تسبب موت الخلايا المبرمج عندما تصادف خلايا طائفة واسعة من الضغوط السامة للخلايا. هذه الإهانات بدء شلالات الإشارات التي تسبب في نهاية المطاف اطلاق سراح ج السيتوكروم من مساحة intermembrane الميتوكوندريا إلى السيتوبلازم 2. إطلاق سراح ج السيتوكروم من الميتوكوندريا هي الحدث الرئيسي الذي يقوم بتشغيل التنشيط السريع للcaspases ، والبروتياز الرئيسية الخلوية التي تنفذ في نهاية المطاف موت الخلية 3-4.
وينظم المسار من موت الخلايا المبرمج في نقاط المنبع والمصب للإفراج ج السيتوكروم من الميتوكوندريا 5. من أجل دراسة اللائحة بعد الميتوكوندريا تفعيل caspase ، تحولت العديد من المحققين إلى microinjection هيولي مباشرة holocytochrome ج (الهيم المرفقة) البروتين في الخلايا 6-9. عادة يكون موضعيا ج السيتوكروم إلى الميتوكوندريا حيث تعلق مجموعة الهيم هو ضروري لتمكينها من تنشيط الخلايا 10-11. لذلك ، لتنشيط caspases مباشرة ، فمن الضروري لحقن البروتين ج holocytochrome بدلا من [كدنا] ، وذلك لأن في حين أن التعبير عن السيتوكروم ج من يبني [كدنا] سيؤدي في استهداف الميتوكوندريا والتعلق الهيم ، وسيتم عزلها فإنه من caspases عصاري خلوي. وبالتالي ، فإن microinjection المباشر عصاري خلوي من الهيم المرفقة تنقية البروتين ج السيتوكروم هو أداة مفيدة لتقليد الميتوكوندريا الافراج ج السيتوكروم وموت الخلايا المبرمج من دون استخدام الشتائم السامة التي تسبب تلف الخلايا والميتوكوندريا.
في هذه المقالة ، نحن تصف طريقة لmicroinjection ج السيتوكروم من البروتين في الخلايا ، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) والخلايا العصبية المتعاطفة الابتدائية ، والأمثلة على ذلك. في حين يركز هذا البروتوكول على حقن ج السيتوكروم من أجل التحقيق في موت الخلايا المبرمج ، ويمكن أيضا التقنيات المعروضة هنا يمكن تكييفها بسهولة للmicroinjection من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.
Protocol
Discussion
وmicroinjection من ج السيتوكروم مباشرة في سيتوبلازم الخلايا هي أداة فريدة وقوية والذي يسمح للدراسات من اللائحة بعد الميتوكوندريا من موت الخلايا المبرمج. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية لتفعيل المصب مباشرة لموت الخلايا المبرمج من الميتوكوندريا من دون استخدام العوامل ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS042197 MD. وأيد AJK من المنح وT32GM008719 F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
Riferimenti
- Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. Cell death: critical control points. Cell. 116, 205-219 (2004).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933 (2001).
- Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature. 407, 770-776 (2000).
- Fuentes-Prior, P., Salvesen, G. S. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem. J. 384, 201-232 (2004).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
- Brustugun, O. T., Fladmark, K. E., Doskeland, S. O., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. Apoptosis induced by microinjection of cytochrome c is caspase-dependent and is inhibited by Bcl-2. Cell Death Differ. 5, 660-668 (1998).
- Li, F. Cell-specific induction of apoptosis by microinjection of cytochrome c. Bcl-XL has activity independent of cytochrome c release. J. Biol. Chem. 272, 30299-30305 (1997).
- Deshmukh, M., Johnson, E. M. Evidence of a novel event during neuronal death: development of competence-to-die in response to cytoplasmic cytochrome c. Neuron. 21, 695-705 (1998).
- Vaughn, A. E., Deshmukh, M. Glucose metabolism inhibits apoptosis in neurons and cancer cells by redox inactivation of cytochrome c. Nat. Cell Biol. 10, 1477-1483 (2008).
- Yang, J. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science. 275, 1129-1132 (1997).
- Gonzales, D. H., Neupert, W. Biogenesis of mitochondrial c-type cytochromes. J Bioenerg Biomembr. 22, 753-768 (1990).
- Ellerby, H. M. Establishment of a cell-free system of neuronal apoptosis – comparison of premitochondrial, mitochondrial, and postmitochondrial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178 (1997).
- Neame, S. J., Rubin, L. L., Philpott, K. L. Blocking cytochrome c activity within intact neurons inhibits apoptosis. J. Cell Biol. 142, 1583-1593 (1998).
- Potts, P. R., Singh, S., Knezek, M., Thompson, C. B., Deshmukh, M. Critical function of endogenous XIAP in regulating caspase activation during sympathetic neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 163, 789-799 (2003).
- Estus, S. Altered gene expression in neurons during programmed cell death: identification of c-jun as necessary for neuronal apoptosis. J. Cell Biol. 127, 1717-1727 (1994).
