Apoptosis साइटोक्रोम के cytoplasmic Microinjection द्वारा सक्रियकरण ग</em
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम साइटोक्रोम के प्रत्यक्ष cytoplasmic microinjection वर्णन<em> ग</em> Fibroblasts और प्राथमिक सहानुभूति न्यूरॉन्स में प्रोटीन. इस तकनीक साइटोक्रोम की शुरूआत के लिए अनुमति देता है<em> ग</emकोशिकाओं और साइटोक्रोम के रिलीज mimics के cytoplasm में प्रोटीन><em> ग</emMitochondria से, जो apoptosis के दौरान होता है.
Abstract
Apoptosis, या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु, एक संरक्षित और उच्च विनियमित मार्ग है जिसके द्वारा कोशिकाओं मर जाते हैं 1. Apoptosis जब कोशिकाओं साइटोटोक्सिक तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला का सामना करने के लिए ट्रिगर किया जा सकता है. ये अपमान cascades संकेत है कि अंततः साइटोक्रोम ग के mitochondrial intermembrane अंतरिक्ष से 2 cytoplasm के लिए रिहाई के कारण आरंभ करें. mitochondria से साइटोक्रोम ग की रिहाई एक महत्वपूर्ण घटना है कि caspases, कुंजी सेलुलर proteases जो अंततः कोशिका मृत्यु 3-4 निष्पादित की तेजी सक्रियण चलाता है.
apoptosis के मार्ग 5 mitochondria से साइटोक्रोम ग रिलीज के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम बिंदुओं पर विनियमित है. आदेश में बाद mitochondrial कस्पासे सक्रियण के नियमन का अध्ययन करने के लिए, कई जांचकर्ताओं holocytochrome (heme संलग्न) 6-9 कोशिकाओं में प्रोटीन ग के प्रत्यक्ष cytoplasmic microinjection में बदल गया है. साइटोक्रोम ग सामान्य mitochondria जहां एक heme समूह के अनुलग्नक यह 10-11 apoptosis को सक्रिय करने के लिए सक्षम करने के लिए आवश्यक है के लिए स्थानीयकृत है. इसलिए, सीधे caspases को सक्रिय करने के लिए, यह आवश्यक है holocytochrome ग के बजाय अपने सीडीएनए प्रोटीन इंजेक्षन, क्योंकि जबकि सीडीएनए constructs से साइटोक्रोम ग की अभिव्यक्ति mitochondrial लक्ष्यीकरण और heme अनुलग्नक में परिणाम देगा, यह साइटोसोलिक caspases से तनहा हो जाएगा. इस प्रकार, शुद्ध heme संलग्न साइटोक्रोम ग प्रोटीन के प्रत्यक्ष साइटोसोलिक microinjection विषाक्त अपमान जो सेलुलर और mitochondrial क्षति के कारण के उपयोग के बिना mitochondrial साइटोक्रोम ग रिलीज और apoptosis की नकल के लिए एक उपयोगी उपकरण है.
इस अनुच्छेद में, हम कोशिकाओं में साइटोक्रोम ग प्रोटीन की microinjection के लिए एक विधि का वर्णन, माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts और उदाहरण के रूप में प्राथमिक सहानुभूति न्यूरॉन्स का उपयोग. हालांकि यह प्रोटोकॉल apoptosis की जांच के लिए साइटोक्रोम ग के इंजेक्शन पर केंद्रित है, यहाँ दिखाया तकनीक भी ब्याज की अन्य प्रोटीन की microinjection के लिए आसानी से कर सकते हैं अनुकूलित किया जा.
Protocol
Discussion
कोशिकाओं के cytoplasm में सीधे साइटोक्रोम ग के microinjection एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण है जो apoptosis के बाद mitochondrial विनियमन के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक mitochondria की apoptosis बहाव के एजेंटों जो से?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के एमडी NIH अनुदान NS042197 द्वारा समर्थित किया गया. एजेके T32GM008719 और F30NS068006 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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