Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em
Summary
In questo protocollo, si descrive la microiniezione diretta citoplasmatico del citocromo<em> C</emProteine> in fibroblasti e primario neuroni simpatici. Questa tecnica permette l'introduzione del citocromo<em> C</emProteine> nel citoplasma delle cellule e imita il rilascio del citocromo<em> C</em> Dai mitocondri, che si verifica durante l'apoptosi.
Abstract
L'apoptosi, o morte cellulare programmata, è un percorso conservato e altamente regolato con cui le cellule muoiono 1. L'apoptosi può essere attivata quando le cellule incontrano una vasta gamma di sollecitazioni citotossici. Questi insulti avviare cascate di segnalazione che alla fine causano il rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrana mitocondriale al citoplasma 2. Il rilascio di citocromo c dai mitocondri è un evento chiave che innesca la rapida attivazione delle caspasi, le proteasi cellulari chiave che alla fine eseguire la morte delle cellule 3-4.
Il percorso di apoptosi è regolata a punti a monte ea valle del rilascio del citocromo c dai mitocondri 5. Per studiare la regolazione post-mitocondriale di attivazione delle caspasi, molti ricercatori si sono rivolti a microiniezione diretta citoplasmatica di holocytochrome c (eme-allegato) delle proteine nelle cellule 6-9. Citocromo c è normalmente localizzato nei mitocondri, dove l'attaccamento di un gruppo eme è necessaria per poter attivare l'apoptosi 10-11. Pertanto, per attivare direttamente caspasi, è necessario iniettare la proteina c holocytochrome invece del suo cDNA, perché mentre l'espressione del citocromo c dai costrutti cDNA si tradurrà in targeting mitocondriale e attaccamento eme, sarà sequestrato dalla caspasi citosolico. Così, la microiniezione diretta citosolica purificata di eme-attached proteina citocromo c è un utile strumento per simulare rilascio del citocromo c mitocondriale e l'apoptosi senza l'uso di insulti tossici che provocano danni cellulari e mitocondriali.
In questo articolo, si descrive un metodo per la microiniezione di proteine citocromo c nelle cellule, usando il mouse fibroblasti embrionali (MEF) e primario neuroni simpatici come esempi. Anche se questo protocollo si concentra sulla iniezione di citocromo c per le indagini di apoptosi, le tecniche qui riportate può anche essere facilmente adattato per microiniezione di proteine di interesse.
Protocol
Discussion
La microiniezione del citocromo c direttamente nel citoplasma delle cellule è uno strumento unico e potente che permette di studi di post-regolazione dell'apoptosi mitocondriale. È importante sottolineare che questa tecnica permette l'attivazione diretta di valle apoptosi dei mitocondri, senza l'uso di agenti che causano il danno cellulare o mitocondriale.
Anche se questo protocollo si è concentrata sulla microiniezione di citocromo c per gli studi sulla apop…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere NS042197 a MD. AJK è stato supportato da sovvenzioni T32GM008719 e F30NS068006.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| DM IRE2 Inverted Microscope | Leica | ||
| PC-10 Microinjection Needle Puller | Narishige | ||
| MWO-202 Micromanipulator | Narishige | ||
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | ||
| Thin-wall Boroscilicate Capillary Glass with Microfilament | A-M Systems | 615000 | 4 inch length, 1.00 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average molecular weight ~70,000 Da |
| Bovine Cytochrome c Protein | Sigma-Aldrich | C3131 |
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