Summary

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

Published: May 16, 2011
doi:

Summary

Bu protokol, kültür hücreleri üzerine yapıştırılır birimler oluşturan bakteri kolonisi sayısının sayma oluşan basit bir bakteriyel yapışma testtir. Testin sağlam, adhesin bağımsız olarak okudu ve çeşitli varyasyonlar bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan çoğu laboratuvarlarda kullanılır.

Abstract

Enfeksiyonlara neden, bakteri, ev sahibi kolonize gerekir. Bakteriyel patojenler, hücreleri 1 barındırmak için ek teşvik etmek için mümkün olan çeşitli moleküller veya yapıları ifade eder. Bu adhezinleri konak hücre yüzey reseptörleri veya bakteri ve ev sahibi arasında bir köprü olarak hareket çözünür proteinler ile etkileşim güveniyor. Yapışma işgali ve / veya toksin salgılanması önce kritik bir ilk adım, bu nedenle bakteriyel patogenezi incelenmesi gereken önemli bir olay. Ayrıca, uyulması bakteri genellikle zarif ince ayar hücresel yanıtları, 'cep mikrobiyoloji' 2 alanına doğum yapmış olan çalışmalar neden. Bakteriyel konak hücrelerine yapışma ve istila için sağlam testler, bu nedenle bakteriyel patogenezi çalışmalarda kilit rol oynayan ve uzun birçok öncü laboratuarlar 3,4 kullanılmıştır . Bu testler bakteriyel patogenezi üzerinde çalışan laboratuvarlar tarafından uygulanmaktadır.

Burada, belirli bir adhesin katkıları gösteren standart bir bağlılık tahlil açıklar. Biz, Escherichia coli suşu 2787 5, Diffüz bağlılık (AIDA) ile ilgilendim Autotransporter Adhesin ifade eden bir insan patojenik kullanın . Kontrol olarak, Aida gen, 2787Δ aida (F. Berthiaume ve M. Mourez, yayınlanmamış), ve E. ticari bir laboratuvar suşu yoksun bir mutant suşu coli, C600 (New England Biolabs). Bakteriler yaygın olarak kullanılan HEp-2 insan epitel hücre hattı hücrelerinde uymak bırakılır. Bu testte, 6 önce, daha az yoğun tarif edilmiştir .

Protocol

1. Ön: Bakteriyel suşlar ve epitel hücreleri. Hücre ve bakteri manipülasyonlar laminer akış kaputu altında aseptik yapılmaktadır. Taze E. izole coli suşlarının 2787, 2787Δ aida C600 gliserol stokları Lysogeny Broth (LB) agar plakları (% 1 Tripton,% 0.5 sodyum klorür,% 0.5 maya özü,% 1.5 agar) ve 37 büyümeye ° C Tayininde değişkenliği en aza indirmek için, taze kaplama suşlar her zaman kullanmak ve sadece birkaç hafta maksimum …

Discussion

Bu protokol işgali çalışma (gentamisin koruma tahlil 3 kullanarak) modifiye edilebilir bir standart bakteriyel aderans deneyi açıklar. Koloni oluşturan birim sayma, Giemsa boyama gibi yaklaşımlar, mikroskop altında standart görselleştirme teknikleri dayanarak ile karşılaştırıldığında, ölçme sağlar. İkincisi, sadece yapışma niteliksel bir görünüm verir ama yapışma çeşitli desenler farklılaştırmak ve mechanistical anlayışlar vermek 9 yılından bu yana sık sık …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü ve Kanada Araştırma Sandalyeler programı hibe yazarların laboratuarlarda çalışmalar desteklenmektedir. JL Viyana de Recherche en Sante du Quebec fon yoluyla Groupe d'Etüt des Protéines Membranaires (GEPROM) bir burs ile desteklenmektedir.

Materials

Reagent Company Catalogue number
High glucose DMEM GIBCO-Invitrogen 12430-054
DDPBS GIBCO-Invitrogen 14190-144
Bovine Growth Serum Hyclone SH3054
Penicillin/Streptomycin GIBCO-Invitrogen 15140-148
24 well plates Corning 3337
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100

Riferimenti

  1. Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
  2. Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
  3. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-405 (1994).
  4. Pizarro-Cerda, J., Lecuit, M., Cossart, P., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 161-161 (2002).
  5. Srivastava, A., Isberg, R. R., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Molecular Cellular Microbiology. , 179-179 (2002).
  6. Benz, I., Schmidt, M. A. Cloning and expression of an adhesin (AIDA-I) involved in diffuse adherence of enteropathogenic Escherichia coli. Infect Immun. 57, 1506-1506 (1989).
  7. Charbonneau, M. E., Berthiaume, F., Mourez, M. Proteolytic processing is not essential for multiple functions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I). J Bacteriol. 188, 8504-8504 (2006).
  8. Jacques, M., Paradis, S. E. Adhesin-receptor interactions in Pasteurellaceae. FEMS Microbiol Rev. 22, 45-45 (1998).
  9. Auger, E. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. Infect Immun. 77, 1426-1426 (2009).
  10. Jacques, M. Role of lipo-oligosaccharides and lipopolysaccharides in bacterial adherence. Trends Microbiol. 4, 408-408 (1996).
  11. Nataro, J. P., Kaper, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 11, 142-142 (1998).
  12. Jallat, C., Darfeuille-Michaud, A., Rich, C., Joly, B. Survey of clinical isolates of diarrhoeogenic Escherichia coli: diffusely adhering E. coli strains with multiple adhesive factors. Res Microbiol. 145, 621-621 (1994).

Play Video

Citazione di questo articolo
Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (51), e2783, doi:10.3791/2783 (2011).

View Video