Vibratome Corti के स्तनधारी अंग के Cytoarchitecture की बढ़ी संरक्षण के लिए सेक्शनिंग
Summary
Vibratome का एक सरल प्रक्रिया Corti के अंग, immunohistochemistry और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा सेक्शनिंग वर्णित है. यह प्रक्रिया Corti के स्तनधारी अंग ठीक cytoarchitecture के बेहतर संरक्षण के लिए अनुमति देता है, और फलस्वरूप सेल प्रकार की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Corti के स्तनधारी अंग mechanosensory बाल और nonsensory समर्थन कोशिकाओं के एक उच्च आदेश दिया सेलुलर मोज़ेक है
(1,2 में समीक्षा) इस सेलुलर मोज़ेक के विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर की आवश्यकता है कि Corti के पार sectioned अंग है. विशेष रूप से, nonsensory स्तंभ और DEITERS कोशिकाओं, जिसका नाभिक बालों की कोशिकाओं के लिए सम्मान के साथ basally स्थित Corti के अंग पार – सेक्शनिंग के बिना कल्पना नहीं किया जा सकता है. हालांकि, Corti के स्तनधारी अंग के नाजुक cytoarchitecture, स्तंभ और DEITERS कोशिकाओं के ठीक cytoplasmic प्रक्रियाओं सहित, आयल और क्रायो सेक्शनिंग जैसे नियमित histological प्रक्रियाओं, जो मानक immunohistochemical धुंधला तकनीक के साथ संगत कर रहे हैं द्वारा संरक्षित करने के लिए मुश्किल है.
यहाँ मैं एक सरल और मजबूत कोक्लीअ, पूरे माउंट में इन vibratome वर्गों के immunohistochemical धुंधला हो जाना, confocal माइक्रोस्कोपी के बाद के सेक्शनिंग vibratome से मिलकर प्रक्रिया का वर्णन. यह प्रक्रिया माउस अंग कली, zebrafish पेट, यकृत, अग्न्याशय, और दिल (3-6 देख चयनित उदाहरण के लिए) सहित कई अंगों के immunhistochemical विश्लेषण के लिए किया गया है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया . इसके अलावा, दोनों और स्तंभ दोनों भ्रूण और वयस्क चूहे 7 में उत्परिवर्ती और नियंत्रण Corti के अंगों में सेल नंबर के इमेजिंग quantitificaton के लिए इस कार्यविधि का sucessful था . इस विधि, तथापि, वर्तमान Corti के स्तनधारी अंग की जांच व्यापक रूप से इस्तेमाल नहीं किया. इस प्रक्रिया के लिए संभावित दोनों Corti के वयस्क अंग ठीक cytoarchitecture बढ़ाया संरक्षण प्रदान करने और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देते हैं वर्णित है.
Protocol
Discussion
vibratome सेक्शनिंग, immunohistochemistry और confocal इमेजिंग द्वारा बाद की प्रक्रिया कम से कम ऊतकों को नुकसान के साथ Corti के अंग के दृश्य के लिए अनुमति देता है. जाहिर है, confocal vibratome अनुभाग में आंतरिक क्षेत्रों से लिया छवियों निर्धार?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक बच्चों अनुसंधान संस्थान इमेजिंग कोर के confocal और सुझाव के लिए माइक्रोस्कोपी डा. Jian झांग के लिए उपयोग को स्वीकार करने के लिए agarose मोती का उपयोग कर वर्गों माउंट करना चाहते हैं. यह काम DC010387 NIH अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
Riferimenti
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
