Summary
描述一个新的DC抗原特异性T细胞的诱导和扩张的独立方法。基于HLA A2 - Ig的人工抗原提呈细胞(AAPC)加载与HLA - A2限制性肽能够有效地扩大多样化的抗原特异性CTL的。该技术拥有CTL为基础的过继免疫治疗的巨大潜力。
Abstract
CTL的最佳效应功能发挥的关键作用,在调解对各种细胞内感染和癌症的保护。然而,个人可能会出现抑制免疫微环境,在激活的CTL,其自体的抗原提呈细胞可能倾向于tolerize或anergize抗原特异性CTL。因此,虽然仍处于实验阶段,CTL为基础的过继免疫治疗已经发展成为一个很有前途的治疗各种疾病,如癌症和病毒感染。在最初的实验中,前体外扩增巨细胞病毒(巨细胞病毒)特异性CTL已用于免疫功能低下的异基因骨髓移植患者巨细胞病毒感染的治疗。虽然是很常见的危及生命的巨细胞病毒血症,在这些患者中没有接收病人扩大的CTL发展巨细胞病毒有关的疾病,这意味着抗CMV免疫过继转移的 CTL 1。可喜的成果也被观察到黑色素瘤,并有可能延长向其他类型的癌症2。
虽然有很多方法体外刺激和扩大人类的CTL,目前的办法是限制的成本和技术的限制。例如,目前的黄金标准是基于使用的自体DC。这就要求每一个病人捐出大量的白细胞,也很昂贵,费力。此外,在体外直流扩大CTL的特性详细透露,这些有唯一不理想的效应功能3。
这里我们提出一个高效的AAPC体外扩增人类巨细胞病毒特异性CTL过继免疫治疗(图1)为基础的系统。 AAPC作了耦合细胞大小的磁珠与人类HLA - A2免疫球蛋白二聚体和抗CD28mAb 4。一旦AAPC是,他们可以满载着各种感兴趣的肽,并保持个月的功能。在这份报告中,AAPC加载与巨细胞病毒,PP65(NLVPMVATV)占主导地位的肽。经过培养纯化与AAPC为期一周的健康捐赠者的人类CD8 + CTL,巨细胞病毒特异性CTL可显着增加的特异性高达98%(图2)和放大10,000倍多。如果需要更多的巨细胞病毒特异性CTL,进一步扩大可轻松实现与AAPC重复刺激。表型和功能分析显示,这些扩大的细胞效应记忆体的表型和TNFα和γ干扰素(图3)大量。
Protocol
1。 HLA - A2 - IG制作,基于AAPC
- 准备无菌硼酸盐缓冲液
- 硼酸在水中溶解,使0.1M。调整pH至7.0。
- 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。
- 准备无菌珠洗涤液
- 以956毫升PBS W / O型的镁或钙。
- 添加30毫升人AB血清。
- 添加EDTA的2MM终浓度。
- 0.1gsodium叠氮化物。
- 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。
- 从Invitrogen公司的M - 450环氧珠1毫升股票,约400万珠(珠可以通过血球计数),并放入无菌,螺杆顶部的玻璃小瓶。
- 把小瓶针对DYNAL磁铁MPC - 1,而珠坚持一侧小瓶,除去吸上清液。一次洗珠,硼酸盐缓冲液1毫升。
- 为1ml硼酸缓冲液HLA - A2免疫球蛋白二聚体的抗人CD28单克隆抗体(克隆9.3)和20微克和20微克的混合物悬浮珠。
- 蛋白质珠共轭:上肩的玻璃小瓶和旋转4 ° 24小时。
- MPC - 1磁铁放置在管,并删除所有的硼酸盐缓冲。
- 珠用1ml洗涤液洗磁珠两次。
- 孵育1毫升珠洗涤液珠,旋转4 ° 24小时。由于珠洗涤液中含有人AB血清,它会阻止所有剩余的蛋白结合位点上的珠子。
- 从玻璃小瓶中取出上清液,用1ml新鲜珠洗涤液取代。
2。 AAPC肽加载,存储的质量控制
- 〜5 × 10 5珠添加100μL流式细胞仪,流式细胞仪管清洗缓冲和染色加入1μl抗鼠IgG1 - PE(识别的HLA - A2免疫球蛋白的Fc部分)和抗鼠IgG2a - FITC加入1μl(承认抗CD28单克隆抗体的Fc部分)。染色洗涤液的流式细胞仪20分钟后,洗一遍,并宣读染色结果立即用流式细胞仪(图4)。
- 肽加载到珠:玻璃小瓶用1ml无菌PBS洗两次珠。用1ml无菌PBS重悬,然后加入加入10μl的CMV肽(1mg/ml的)
- 通过血球计数珠,标签的日期和浓度的小瓶。
- AAPC使用后至少3天肽的潜伏期在4 ° C,准备允许有足够的时间到HLA - A2免疫球蛋白二聚体肽结合。珠可以被保存在4 ° C,并保持至少6个月的功能。
3。人类的CTL隔离
- 收集来自健康的HLA - A2阳性捐助10 BD肝素钠真空采血管管〜新鲜的外周血百毫升。使用了21号针头或更大,以防止溶血。
- 在室温下离心10分钟,在300xg
- 小心地取出吸顶级的等离子层。血浆可以用来作为补充培养基。
- 替换用无菌PBS收集的血浆和血液转移到无菌的T75培养瓶或锥形管50毫升。用PBS的血液充分混合,上下吹打起来。
- 一旦所有的血液收集,准备4个额外的50毫升锥形管和加入聚蔗糖 - 帕确加15毫升。
- 慢慢地覆盖3035毫升上方聚蔗糖各管血细胞。接口之间的聚蔗糖和血细胞明显。
- 在500xg离心机在室温下20分钟。打开刹车“关闭”和加速度尽可能低,以保持层与层之间的界面清晰。
- 使用seriological吸管,小心吸外周血单个核细胞层,并收集到一个新的50ml的锥形管的PBMC中。当所有PBMC的收获添加400xg PBS和自旋30毫升10分钟。丢弃的上清,用PBS30毫升更多的时间来删除所有剩余的聚蔗糖。
- 通过美天旎人力,CD8 + T细胞分离试剂盒,根据制造商的协议进行的CD8 + T细胞的分离。该试剂盒的高度丰富CD8 +细胞(通常> 95%)消耗CD8 -细胞。
- CD8 + T细胞计数。预期的纯度应大于95%。为了证实这一点使用2 × 10 5细胞和执行CD4/3/8流式细胞仪分析。其余的CTL可以马上使用抗原特异性AAPC刺激,也可以冻结供日后使用。
在体外 AAPC为基础的文化系统4。
- 准备培养基
- 为TF(T细胞生长因子,在实验室4)2X的培养基:完全RPMI中加5%自体血浆和8%的T细胞生长因子的捐助。
- 悬浮1万TF 2X培养液中加完全RPMI培养基8毫升8毫升的CTL,加1 × 10 6 AAPC,拌匀。
- 到96 ü底部组织培养板,使用多渠道pipetter板细胞。 (每孔160μL)
- 培养细胞在37℃,5%的CO 2 incubater 7天。第4天与80μL/ TF 2X中等饲料细胞。
- 细胞是准备7天收获。收获后,将细胞对磁铁,并删除旧的AAPC。
- 抗原特异性,可根据制造商的协议,由四聚体染色。根据我们以前的研究3表型染色和细胞内细胞因子染色。
- replated提取的干细胞可以在相同条件下与AAPC再次。反复刺激后预计将增加细胞数量和抗原特异性。
5。代表性的成果:
AAPC后HLA A2 - IG和抗CD28的共轭的例子如图4所示。成功的蛋白共轭是显而易见的,由相应的抗体染色的明显转变。虽然外周血中的巨细胞病毒特异性CTL的频率通常是0.5-1%的AAPC介导的刺激单周后,特异性可以达到55 - 93%(图2和3)。抗原特异性CTL的扩张可以是非常不同的捐助者之间的变量,但结果是在同一捐助重现。扩大巨细胞病毒特异性细胞可以推断,数千倍,易制毒化学水平直接体外(数据未显示) 。细胞内细胞因子染色(图3)表明,这些扩大的CTL官能,而不是消耗殆尽,经过长时间的细胞培养和显着增生。
图1代表AAPC基于前人类CTL的体外扩增流在异体造血干细胞移植的过继免疫治疗的图表
图2代表四聚体染色结果AAPC产生一个文化周后巨细胞病毒特异性的CTL
图3。代表AAPC产生的巨细胞病毒特异性的CTL细胞内细胞因子染色结果细胞病毒(CMV特异性为61% )
蛋白共轭抗鼠IgG1 - PE和抗鼠IgG2的- FITC染色后的M - 450环氧珠代表染色结果图4。
Discussion
AAPC系统,我们在这里描述的是一个有效率的制度,为人类CTL体外对多种抗原扩张。应特别注意在96孔板文化方面所采取的蛋白共轭的质量和均匀分布AAPC和CTL。使用这种方法我们已经能够扩大的CTL,为8周以上,在此期间,我们扩大抗原特异性CTL百万倍 4 。有各种人造的APC系统,利用细胞株或其他无细胞平台 5,但是,根据公布的数据,每个系统都有其独特的外形扩张和特异性方面支持不同的应用。更重要的是,自CTL的质量和数量的重要,我们的系统所产生的巨细胞病毒特异性CTL polyfunctionality预计赋予优异的抗病毒的效率。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢阿龙Selya有益的讨论。这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予AI29575,CA108835,AI077097的JS,从约翰霍普金斯疟疾研究所的试验赠款和国防部授予的PC 040972部莫
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Vacutainer tube (contains heparin) | BD Biosciences | 367874 | |
Human CD8+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Invitrogen | 140.11 | |
Dynal MPC-1 Magnet | Invitrogen | 120-01D | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
RPMI medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
HLA-A2-Ig dimer X | BD Biosciences | 551263 | |
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE | Beckman Coulter Inc. | T20099 | |
Falcon clear 96-well Microtest plate | BD Biosciences | 353077 | |
Rat anti-mouse IgG2a-FITC | BD Biosciences | 553390 | |
Goat anti-mouse IgG1-PE | Invitrogen | P21129 | |
Human serum type AB | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Mouse anti-human CD8a-FITC | Sigma-Aldrich | F0772 | |
Mouse anti-human CD8a-APC | BD Biosciences | 340684 | |
Mouse anti-human IFNγ-FITC | BD Biosciences | 340449 | |
Mouse anti-human TNFα-PE | BD Biosciences | 340512 |
References
- Walter, E. A. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).
- Rosenberg, S. A. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).
- Oelke, M. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nat Med. 9, 619-619 (2003).
- Oelke, M. Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases. Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).