Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal
Summary
Nós apresentamos um método para imunoprecipitação da cromatina do tecido da raiz dorsal após lesão axonal gânglios. A abordagem pode ser usada para identificar locais de transcrição específicos fator determinante e importante modificação epigenética de histonas e DNA para a regeneração de axônios lesados tanto no sistema nervoso periférico e central.
Abstract
Axônios no sistema nervoso central (SNC) não se regeneram, enquanto as do sistema nervoso periférico (SNP) se regeneram de forma limitada após a lesão (Teng et al., 2006). Reconhece-se que os programas de transcrição essencial para crescimento de neuritos e axonal são reativados após lesão no PNS (Makwana et al., 2005). No entanto as ferramentas disponíveis para analisar regulação gênica neuronal in vivo são limitados e muitas vezes desafiador.
Os gânglios da raiz dorsal (DRG) oferecem um sistema excelente modelo prejuízo, porque tanto o CNS e PNS são inervados por um axônio bifurcada proveniente da soma mesma. Os gânglios representar uma coleção discreta de corpos celulares, onde todos os eventos ocorrem de transcrição, e assim fornecer uma região claramente definida de atividade transcricional que pode ser facilmente reproduzível e retirado do animal. Lesão de fibras nervosas no PNS (por exemplo, nervo ciático), onde a regeneração axonal ocorre, deve revelar um conjunto de programas de transcrição que são distintas das respondendo a uma lesão similar no sistema nervoso central, onde a regeneração não ocorre (por exemplo, na medula espinhal ). Sites para o fator de transcrição de ligação, histona e modificação de DNA resultante da lesão a qualquer PNS ou SNC podem ser caracterizadas usando cromatina imunoprecipitação (chip).
Aqui, nós descrevemos um protocolo chip usando tecido DRG fixo rato após lesão axonal. Esta poderosa combinação oferece um meio para caracterizar o ambiente cromatina pró-regeneração necessária para promover a regeneração axonal.
Protocol
Discussion
Este protocolo fornece um método para solicitar directamente sobre o meio ambiente cromatina durante a regeneração axonal no sistema nervoso adulto após lesão axonal. Ele incorpora o modelo de lesão DRG com imunoprecipitação da cromatina para sondar o ambiente de transcrição e epigenéticos após a lesão ou o PNS ou CNS. É particularmente útil para pesquisadores que gostariam de caracterizar suposta sítios de ligação para o seu fator de transcrição favorito, e para determinar se a ocupação destes loc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Andrea Tedeschi para ajudar na definição das experiências ChIP inicial em laboratório e Lindner Ricco por sua contribuição para afinar as condições para ChIP. Este trabalho foi financiado pela Fundação Hertie, o Grant Fortune, Universidade de Tuebingen, ea DFG concede DI 1497/1-1 (todos concedida a Simone Di Giovanni).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Riferimenti
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
