אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts
Summary
התרבות של תאים נורמליים בהקשר שלהם תלת ממדי מייצג שיטה חלופית לחקור אירועים מוקדם נדרש שינוי tumorigenesis הסלולר. שיטה זו משמשת לגדול השחלות נורמלי תאים oviductal ללמוד האירועים מוקדם להיווצרות סרטן השחלות.
Abstract
סרטן השחלות הוא הגורם המוביל החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים יש שיעור תמותה 63% בארצות הברית 1. סוג תא המוצא עבור סרטן השחלות עדיין השאלה יכול להיות גם על פני השחלות אפיתל (OSE) או אפיתל דיסטלי של fimbriae את החצוצרה 2,3. Culturing תאים נורמליים כתרבות ראשוני במבחנה יאפשר למדענים מודל שינויים ספציפיים שעשויים לגרום לסרטן השחלות האפיתל ברורים, ובכך לקבוע בוודאות את סוג התא המוצא. זה יאפשר פיתוח של סמנים ביולוגיים יותר מדויק, במודלים של בעלי חיים עם ספציפיים רקמות שינויים גן, אסטרטגיות מניעה טובה יותר ממוקד המחלה.
שמירה על תאים נורמליים הידרוג אלגינט לטווח קצר מקדמת תרבות של תאים במבחנה בהקשר שלהם תלת מימדי ומאפשרת המבוא של ה-DNA פלסמיד siRNA, ומולקולות קטנות. על ידי איברים culturing לחתיכות כי הם שנבעו מקיצוצים אסטרטגי באמצעות אזמל, תרבויות מספר מאיבר אחד יכול להיות שנוצר, הגדלת מספר ניסויים מבעל חיים אחד. קיצוצים אלו היבטים מודל הביוץ מוביל לשגשוג של OSE, אשר מזוהה עם היווצרות סרטן השחלות. סוגי תאים כגון OSE כי אינם גדלים היטב על משטחי פלסטיק יכול להיות מתורבת בשיטה זו ולהקל על חקירת תהליכים תאיים רגיל או את האירועים המוקדמים להיווצרות סרטן 4.
הידרוג אלגינט יכול לשמש כדי לתמוך בצמיחה של סוגים רבים של רקמות 5. אלגינט הוא פוליסכריד ליניארי מורכב יחידות חוזרות של חומצת-D-mannuronic β ו α-L-guluronic חומצה שניתן crosslinked עם יוני סידן, וכתוצאה מכך פעולה gelling עדין שאינו נזק לרקמות 6,7. כמו אחרים תלת ממדי התרבות מטריצות תאים כגון Matrigel, אלגינט מספק תמיכה מכאנית עבור רקמות, אולם החלבונים אינם תגובתי עם המטריצה אלגינט, ולכן פונקציות אלגינט כמטריצה תאיים סינתטי שלא ליזום התא איתות 5. הידרוג אלגינט מרחפת בתווך תא רגיל התרבות תומך ארכיטקטורת הצמיחה רקמות במבחנה.
השיטה מוצגת להכנת, הפרדה, והטבעה של השחלות חתיכות איברים oviductal לתוך הידרוג אלגינט, אשר ניתן לשמור על תרבות של עד שבועיים. לשחרר האנזימטית של תאים לניתוח דגימות RNA חלבונים מן התרבות איבר מתואר גם. לבסוף, את הצמיחה של תאים מסוגים ראשוני ניתן ללא הנצחה גנטי מעכברים היתרי החוקרים להשתמש בנוקאאוט ואת העכברים הטרנסגניים.
Protocol
Discussion
הפיתוח של מערכת תלת מימדי איבר תרבות ניצול הידרוג אלגינט מייצג שיטה לניתוח תכליתי הרבה סוגי רקמות שונים ממגוון רחב של אורגניזמים. השימוש תרבויות 3D ניתן להרחיב בתחומי הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית כפי שהוא מספק פיגום שעליו התאים יכולים לגדול 11. נכון לעכשיו, במעב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מחקר על סרטן השחלות קרן [מענק LT/UIC/01.2011], מרכז UIC למדע Translational קלינית, המרכז לסרטן UIC, לבין המכון הלאומי לבריאות מענק C06RR15482.
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי AAALAC תחת אושרה לטיפול בפרוטוקולים בעלי חיים על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת השתמש ב UIC. בעלי חיים עבור פרויקט זה הם שוכנו בחדרים המכשול הביולוגי משאבי המעבדה (BRL) באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. BRL יש צוות וטרינרי מלא המנטרת בעלי חיים לפחות פעמיים ביום, ומספק עצות לטיפול בבעלי חיים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leibovitz L-15 medium | Gibco | 11415 | |
| αMEM medium | Gibco | 12000-022 | |
| Sodium alginate | Novamatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster Carr | 45″ wide roll; 0.0041″ opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | Gibco | |
| ITS solution | Roche | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Labs | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
Riferimenti
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , .
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation–a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
