Immuno Assay-fluorescentie van Leptospiral Surface-blootgesteld Eiwitten
Summary
Een efficiënte methode om het oppervlak-blootstelling van leptospiral eiwitten te bepalen is beschreven. De methode is speciaal ontworpen om verstoring van de kwetsbare buitenste membraan van leptospiral cellen te voorkomen. Deze techniek vergt inzet van een aantal negatieve controles te beoordelen van de integriteit van de buitenste membraan en de specificiteit van de antistof reactie.
Abstract
Bacteriële oppervlakte-eiwitten betrokken zijn bij direct contact met gastheercellen en in de opname van voedingsstoffen uit het milieu 1. Om deze reden kan cellulaire lokalisatie geven inzicht in de functionele rol van bacteriële eiwitten. Oppervlak lokalisatie van bacteriële eiwitten is een belangrijke stap op weg naar de identificatie van virulentiefactoren betrokken bij mechanismen van pathogeniteit.
Methoden voor het fractioneren leptospiral membranen 02-05 mei selectief zijn voor een bepaalde klasse van de buitenste membraan-eiwitten (Omps), zoals lipoproteïnen versus transmembrane Omps, en dus leiden tot misclassificatie. Dit waarschijnlijk is te wijten aan structurele verschillen en hoe ze worden geassocieerd met de buitenste membraan. Lipoproteïnen worden geassocieerd met membranen via een hydrofobe interactie tussen de N-terminale lipide-groep (drie vetzuren) en het lipide bilaag fosfolipiden 6, 7. In tegenstelling, zijn transmembraan Omps meestal geïntegreerd in de lipide bilaag door amfipathisch β-sheets die in een vat-achtige structuur 8, 9. Bovendien betekent de aanwezigheid van een eiwit in de buitenste membraan niet per se garanderen dat het eiwit of haar domeinen worden blootgesteld aan de oppervlakte. Spirochetal buitenste membranen is bekend dat ze kwetsbaar en dit betekent dat methoden waarbij zachte manipulatie van cellen en opneming van sub-oppervlakte-eiwit regelt het beoordelen van de integriteit van de buitenste membraan.
Hier presenteren we een immunofluorescentie assay (IFA) methode om rechtstreeks te beoordelen oppervlak blootstelling van eiwitten op intact leptospiren. Deze methode is gebaseerd op de erkenning van leptospiral oppervlakte-eiwitten door antigeen-specifieke antilichamen. Hierin worden antilichamen specifiek voor OmpL54 10 detetcted aftero binding aan native, het oppervlak blootgesteld epitopen. Vergelijking van antilichaamreactiviteit intact versus gepermeabiliseerde cellen in staat stelt de evaluatie van de cellulaire distributie en het al dan niet een eiwit selectief aanwezig is op leptospiral oppervlak. De integriteit van de buitenste membraan moet worden beoordeeld met behulp van antilichamen tegen een of meer ondergrondse proteïnen, bij voorkeur gelegen in het periplasma.
Het oppervlak IFA-methode kan worden gebruikt om het oppervlak blootstelling van elke leptospiral eiwit waaraan specifieke antilichamen beschikbaar te analyseren. Zowel het nut en de beperking van de methode hangt af van de vraag of de gebruikte antilichamen kunnen binden de inheemse epitopen. Omdat antilichamen vaak worden opgewekt tegen recombinante eiwitten, epitopen van inheemse, oppervlakte-eiwitten kunnen worden blootgesteld niet worden herkend. Toch is het oppervlak IFA-methode is een waardevol instrument voor het bestuderen van onderdelen van intacte bacteriële oppervlakken. Deze methode kan worden toegepast, niet alleen voor leptospiren, maar ook andere spirocheten en gramnegatieve bacteriën. Voor een sterkere conclusies ten aanzien van oppervlakte-blootstelling van Omps, is een integrale aanpak, waarbij verschillende mobiele lokalisatie methoden aanbevolen 10.
Protocol
Discussion
Onze oppervlak IFA techniek is vergelijkbaar met die gebruikt om het oppervlak blootstelling van de verschillende borrelial 15, 16 en leptospiral 12, 17 eiwitten aan te tonen. De details van het oppervlak IFA hier beschreven methode zijn ontworpen om het manipuleren van cellen te minimaliseren in een poging om buitenste membraan integriteit te behouden terwijl u profiteert van de neiging van Leptospira cellen zich te houden aan glas dia's. Bij deze methode wordt een lagere concentratie (2% vers…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de GGD te verlenen AI-34.431 (tot DAH) van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten en door VA Medical Research Funds (tot DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
Riferimenti
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
