Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas
Summary
Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.
Abstract
La superficie de las proteínas bacterianas están involucradas en contacto directo con las células huésped y en la absorción de nutrientes del medio ambiente 1. Por esta razón, la localización celular puede ayudar a comprender el papel funcional de las proteínas bacterianas. Localización de la superficie de las proteínas bacterianas es un paso clave hacia la identificación de factores de virulencia que participan en los mecanismos de patogenicidad.
Métodos de fraccionamiento 2.5 membranas leptospira puede ser selectiva para una cierta clase de proteínas de la membrana externa (OMP), como las lipoproteínas vs OMPs transmembrana, y por lo tanto, llevar a errores de clasificación. Esto probablemente es debido a las diferencias estructurales y la forma en que están asociados a la membrana externa. Las lipoproteínas se asocia con membranas a través de una interacción hidrofóbica entre la fracción lipídica N-terminal (tres ácidos grasos) y los fosfolípidos bicapa lipídica 6, 7. Por el contrario, OMPs transmembrana suelen estar integrados en la bicapa lipídica por anfipáticas β-hojas dispuestas en una estructura de barril-como 8, 9. Además, la presencia de una proteína en la membrana externa, no garantiza necesariamente que la proteína o sus dominios están expuestos en la superficie. Espiroquetas membranas externas se sabe que son métodos frágil y por tanto, requiere la participación manipulación suave de las células y la inclusión de proteínas de sub-superficie de control para evaluar la integridad de la membrana externa.
A continuación, presentamos un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para evaluar directamente la exposición de la superficie de las proteínas en las leptospiras intacto. Este método se basa en el reconocimiento de proteínas de la superficie de leptospiras por el antígeno de anticuerpos específicos. En esto, los anticuerpos específicos para OmpL54 10 son detetcted aftero vinculante a los nativos epítopos de la superficie, expuestos. Comparación de la reactividad de anticuerpos frente a células intactas permeabilized permite la evaluación de la distribución de celulares y si una proteína está presente en la superficie de forma selectiva leptospirosis. La integridad de la membrana externa deben ser evaluados utilizando anticuerpos contra una o más proteínas del subsuelo, preferentemente en el periplasma.
El método de la superficie de la IFA se puede utilizar para analizar la exposición de la superficie de cualquier proteína de leptospira a que los anticuerpos específicos disponibles. Tanto la utilidad y las limitaciones del método depende de si los anticuerpos empleados son capaces de unirse a epítopos nativos. Dado que los anticuerpos a menudo se levantan contra las proteínas recombinantes, los epítopos de los nativos, expuestas en la superficie las proteínas no pueden ser reconocidos. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una herramienta valiosa para el estudio de los componentes de la superficie bacteriana intacta. Este método se puede aplicar no sólo para las leptospiras, pero también otras espiroquetas y bacterias gram-negativas. Para conclusiones más sólidas sobre la superficie de exposición de OMP, un enfoque integral que implique a varios métodos de localización celular se recomienda 10.
Protocol
Discussion
La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial 15, 16 y leptospirosis 12, 17 proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de subvención AI-34 431 (a DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y VA Fondos de Investigación Médica (a DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
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