उच्च आण्विक वजन डीएनए के माइक्रोबियल मैट से निकालना
Summary
हम hypersaline माइक्रोबियल मैट से उच्च आणविक भार डीएनए निकालने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. माइक्रोबियल कोशिकाओं चटाई मैट्रिक्स से अलग कर रहे हैं डीएनए निष्कर्षण और शुद्धि के लिए पहले. यह सांद्रता, गुणवत्ता, और डीएनए के आकार को बढ़ाता है. प्रोटोकॉल अन्य दुर्दम्य नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
सफल और सटीक metagenomic डेटा का विश्लेषण और व्याख्या उच्च गुणवत्ता, उच्च आणविक वजन (HMW) समुदाय डीएनए के कुशल निकासी पर निर्भर है. हालांकि, पर्यावरण चटाई नमूने अक्सर उच्च गुणवत्ता, HMW डीएनए के बड़े सांद्रता प्राप्त करने में कठिनाइयों मुद्रा. Hypersaline माइक्रोबियल मैट कोशिकी polymeric पदार्थों की उच्च मात्रा (ईपीएस) 1 और लवण कि निकाले डीएनए के बहाव के अनुप्रयोगों को बाधित कर सकते हैं होते हैं. सीधी और कठोर तरीकों अक्सर दुर्दम्य नमूने से डीएनए निष्कर्षण में किया जाता है. इन विधियों आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि मैट, चिपकने वाला एक मैट्रिक्स में ईपीएस प्रत्यक्ष lysis के दौरान 2,3 डीएनए बांध. कठोर निकासी तरीकों का एक परिणाम के के रूप में हो जाता है डीएनए छोटे 4,5,6 आकार में खंडित.
डीएनए इस तरह बड़े सम्मिलित करने के लिए वेक्टर क्लोनिंग के लिए अनुपयुक्त हो जाता है. आदेश में इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, हम अच्छा और hypersaline माइक्रोबियल मैट से गुणवत्ता और मात्रा के HMW डीएनए निकालने के लिए एक बेहतर कार्यप्रणाली की रिपोर्ट. हम एक अप्रत्यक्ष सम्मिश्रण और अंतर centrifugation के माध्यम से पृष्ठभूमि चटाई मैट्रिक्स से माइक्रोबियल कोशिकाओं की जुदाई से जुड़े विधि कार्यरत हैं. यांत्रिक और रासायनिक प्रक्रियाओं का एक संयोजन निकालने और निकाले माइक्रोबियल कोशिकाओं से डीएनए को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारी प्रोटोकॉल एक 1.6 260/280 अनुपात के साथ चटाई नमूना के प्रति ग्राम HMW डीएनए (35-50 केबी) के लगभग 2 μg पैदावार . इसके अलावा, rRNA जीन -16 7 का प्रवर्धन पता चलता है कि प्रोटोकॉल के लिए कम से कम या contaminants के किसी भी निरोधात्मक प्रभाव को खत्म करने में सक्षम है . हमारे परिणाम कार्यात्मक metagenomic अध्ययन के लिए माइक्रोबियल मैट से HMW डीएनए के निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त पद्धति प्रदान करते हैं और अन्य पर्यावरणीय नमूने से डीएनए निष्कर्षण चुनौती दे रहा है के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
यह देखते हुए कि जटिल और उच्च विविध माइक्रोबियल चटाई नमूनों से कुल सेल हटाने व्यावहारिक नहीं है, प्राथमिक चिंता का विषय है कितनी अच्छी तरह निकाली गई कोशिकाओं समग्र माइक्रोबियल चटाई समुदाय का प्रतिनिध?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पर्यावरण जीनोमिक्स कार्यक्रम (अनुदान सं एफई-0,723,707) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
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