Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica
Summary
Forniamo un protocollo migliore per l'estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell'estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.
Abstract
Analisi di successo e preciso e l'interpretazione dei dati metagenomica dipende l'estrazione efficiente di alta qualità, ad elevato peso molecolare (HMW) del DNA della comunità. Tuttavia, i campioni di mat ambientali costituiscono spesso difficoltà ad ottenere grandi concentrazioni di alta qualità, il DNA HMW. Stuoie microbica hypersaline contengono elevate quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 1 e sali che possono inibire le applicazioni a valle di DNA estratto. Metodi diretti e duri sono spesso utilizzati per l'estrazione del DNA da campioni di refrattari. Questi metodi sono generalmente utilizzati perché l'EPS in stuoie, una matrice adesiva, lega il DNA 2,3 durante la lisi diretta. Come risultato di metodi di estrazione più severe, il DNA viene frammentato in piccole dimensioni 4,5,6.
Il DNA diventa così inadeguato per la grande inserto clonazione vettore. Per aggirare queste limitazioni, si riporta un metodo migliore per estrarre il DNA HMW di buona qualità e la quantità di stuoie microbica hypersaline. Abbiamo impiegato un metodo indiretto che coinvolge la separazione di cellule microbiche dalla matrice sfondo opaco attraverso la miscelazione e la centrifugazione differenziale. Una combinazione di procedure meccaniche e chimiche è stato utilizzato per estrarre e purificare il DNA da cellule microbiche estratti. Il nostro protocollo produce circa 2 mg di HMW DNA (35-50 kb) per grammo di campione tappeto, con un 260/280 Un rapporto di 1,6. Inoltre, l'amplificazione dei geni rRNA 16S 7 si evince che il protocollo è in grado di minimizzare o eliminare gli effetti inibitori dei contaminanti. I nostri risultati forniscono una metodologia adeguata per l'estrazione del DNA da HMW stuoie microbica per gli studi funzionali metagenomica e può essere applicabile ad altri campioni ambientali dai quali l'estrazione del DNA è una sfida.
Protocol
Discussion
Dato che la rimozione totale di cellule da campioni microbiche complesse e molto diverse tappetino non è pratico, la preoccupazione principale è come le cellule estratte rappresentano la complessiva comunità microbica tappeto. In uno studio precedente, PCR-DGGE analisi dei geni rRNA 16S microbica ha mostrato che le cinque fasi di rimozione delle cellule utilizzate in questo protocollo estratti di cellule che sono rappresentativi della comunità microbica complessiva tappeto 7. Il numero effettivo di estraz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Programma National Science Foundation Environmental Genomica (Grant No. EF-0723707).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | BDH Chemicals | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Chemicals | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad Laboratories | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP | ||
| Waring blender | Waring laboratory | LB10S |
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