Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Summary

Quantificare i livelli di HIV-1 RNA nel plasma e sequenziamento singolo HIV-1 genomi di individui con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità (50-75 copie / ml) è difficile. Qui si descrive come estrarre e quantificare l'RNA virale plasmatico usando un test PCR in tempo reale che misura affidabile HIV-1 RNA fino a 0,3 copie / ml e come amplificare genomi virali mediante sequenziamento del genoma unico, da campioni con una carica virale molto bassa.

Abstract

Amplificando i geni virali e la quantificazione di HIV-1 RNA di HIV-1 individui infetti con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità da test standard (sotto 50-75 copie / ml) è necessario per ottenere informazioni alla dinamica virale e le interazioni ospite del virus in pazienti che naturalmente controllare l'infezione e coloro che sono in terapia antiretrovirale combinata (CART).

Qui si descrivono come amplificare genomi virali da sequenziamento del genoma singolo (il protocollo SGS) ^{13, 19} e come quantificare con precisione HIV-1 RNA nei pazienti con bassa carica virale (la singola copia saggio (SCA) protocollo) ^{12, 20.}

Il singolo-copia saggio è un real-time PCR con sensibilità a seconda del volume di plasma essere analizzati. Se un singolo genoma del virus viene rilevato in 7 ml di plasma, quindi il numero di copie di RNA è segnalato per essere 0,3 copie / ml. Il test è un test di controllo interno per l'efficienza di estrazione di RNA, e controlli per l'amplificazione del DNA o da possibili contaminazioni. I campioni dei pazienti sono misurati in triplice copia.

Il singolo test di sequenziamento del genoma (SGS), oggi largamente utilizzati e considerati non-lavoro intensivo ^{3, 7, 12, 14, 15,} è un test di diluizione limite, in cui endpoint diluito prodotto cDNA si estende su una da 96 pozzetti piatto. Secondo una distribuzione di Poisson, quando meno di 1 / 3 dei pozzi danno prodotto, c'è una probabilità 80% della risultante prodotto di PCR è di amplificazione da una singola molecola di cDNA. SGS ha il vantaggio sulla clonazione di non essere sottoposto a ricampionamento e di non essere prevenuto mediante PCR-introdotto ricombinazione ^19. Tuttavia, il successo di amplificazione di SCA e SGS dipendono dal disegno primer. Entrambi i saggi sono stati sviluppati per l'Hiv-1 sottotipo B, ma può essere adattato per altri sottotipi e in altre regioni del genoma di primer cambiando, sonde, e standard.

Protocol

1. Estrazione di RNA da grandi volumi di plasma Una panoramica dei test singola copia (SCA) e il singolo sequenziamento del genoma (SGS) protocollo sono forniti nelle figure 1 e 2. Per ottenere 7 ml di plasma, rotazione di circa 14 ml di sangue raccolte in 15 ml di EDTA (non eparina) tubi di raccolta a 2.600 xg per 15 minuti senza freni. Pipettare plasma (avendo cura di evitare lo strato del buffy coat) in provette da 15 ml. Se l'RNA è stato estratto per il saggio s…

Discussion

HIV-1 individui infetti in trattamento antiretrovirale combinata (CART) o che naturalmente controllare l'infezione hanno carica virale molto bassa, in genere circa 1 copia per ml di plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Carica virale nei pazienti con controllo naturale, spesso oscillare intorno ad un singolo set di punto ^{1, 2, 17.} La sensibilità del test è descritto nel presente documento dipende in larga misura il volume di ingresso di plasma. In generale, abbiamo lavorato con 7 ml di plasma, ma i risul…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Random hexamers (500 ug/ml)	Promega	C118A
Taqman buffer A	Applied Biosystems	4304441
RNAsin (40 U/ul)	Promega	N211B
RT enzyme (200 U/ul)	Strategene	600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase	Applied Biosystems	4311814	6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X buffer	Invitrogen		comes with the enzyme
DTT 100 mM	Invitrogen		comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul	Invitrogen	11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer	Invitrogen	11304-102	comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml	Ambion	2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M	FlukaBiochemica	50983
Glycogen 20 mg/ml	Roche	10901393001
Isopropanol	Sigma-Aldrich	19516
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich	E702-3
Molecular grade water	Gibco/Invitrogen	10977-015
dNTPs (25 mmol each)	Bioline	BIO-39025

Name of Euipment	Company	Catalogue number	Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm)	Seaton Scientific	6041
White Delrin crowns	Seaton Scientific	4020	Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml	Beckman	361642
Hex driver ½ inc opening	Seaton Scientific	4013
cap removal tupe	Seaton Scientific	4014
5 ml serological pipettes	Costar	4051
Pipetboy	any
15 ml Transfer pipettes	ISC Bioexpress	P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip	VWR	14670-329
15 ml centrifuge tubes	Falcon
1 ml centrifuge tubes	any
Tris buffer Saline tablets	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor	Sorval	90SE and T-1270
96-well PCR plates	Biorad	HSS-9601
50 ml Reagent reservoir	Costar	4870
Microamp optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems	N801-0560
Optical plate covers	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp Optical Compression Pad	Applied Biosystems	4312639
Microseal A film	Biorad	MSA-5001
2 ml centrifuge tubes	Any
1% agarose gels (E-gel, invitrogen)	Invitrogen	G-7008-01
E-base (Invitrogen)	Invitrogen	EB-M03

EDTA Collection tubes any brand