Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos

Summary

Cuantificación de los niveles de ARN VIH-1 en plasma y la secuencia única de VIH-1 genomas de las personas con cargas virales por debajo del límite de detección (50-75 copias / ml) es difícil. Aquí se describe cómo extraer y cuantificar el ARN viral en plasma utilizando un ensayo de PCR en tiempo real que mide de manera fiable ARN VIH-1 a partir de 0,3 copias / ml y la forma de amplificar el genoma viral mediante secuenciación del genoma individual, a partir de muestras con cargas virales muy bajas.

Abstract

Amplificación de los genes virales y la cuantificación de VIH-1 ARN del VIH-1 las personas infectadas con cargas virales por debajo del límite de detección de los ensayos estándar (por debajo de 50-75 copias / ml) es necesario para comprender mejor la dinámica viral y la interacción virus de acogida en los pacientes que naturalmente, el control de la infección y los que están en tratamiento antirretroviral combinado (TARC).

A continuación se describe la forma de amplificar el genoma viral por la secuenciación del genoma único (el protocolo de SGS) ^{13, 19} y la forma de cuantificar con precisión ARN VIH-1 en pacientes con baja carga viral (la copia de un solo ensayo (SCA) de protocolo) ^{12, 20.}

El ensayo de una sola copia es un ensayo de PCR en tiempo real con la sensibilidad en función del volumen de plasma que se analizaron. Si un solo genoma del virus se detecta en 7 ml de plasma, entonces el número de copias de ARN se informó de que 0,3 copias / ml. El ensayo tiene una prueba de control interno para la eficiencia de la extracción de RNA, y los controles para la amplificación de ADN o posible contaminación. Muestras de los pacientes se midieron por triplicado.

La secuenciación del genoma de un solo ensayo (SGS), muy utilizado y se considera que no mano de obra ^{3, 7, 12, 14, 15,} es un ensayo de dilución límite, en qué extremo diluida cDNA producto se distribuye en un 96-así plato. De acuerdo con una distribución de Poisson, cuando menos de 1 / 3 de los pozos de dar un producto, hay una probabilidad del 80% de la resultante del producto de PCR de la amplificación es de una sola molécula de ADNc. SGS tiene la ventaja sobre la clonación de no ser sometida a muestreo y de no ser sesgado por PCR a introducir recombinación ^19. Sin embargo, el éxito de la amplificación del SCA y SGS dependen de diseño de la cartilla. Ambos ensayos fueron desarrollados para el VIH-1 subtipo B, pero puede ser adaptado para otros subtipos y en otras regiones del genoma de los cebadores cambio, las sondas, y las normas.

Protocol

1. La extracción de RNA a partir de grandes volúmenes de plasma Una visión general de la prueba de copia única (SCA) y el único protocolo de secuenciación del genoma (SGS) se proporcionan en las Figuras 1 y 2. Para obtener 7 ml de plasma, giro de aproximadamente 14 ml de sangre recogidas en 15 ml de EDTA (no heparina) en tubos de recogida de 2.600 g durante 15 minutos sin freno. Pipeta de plasma (asegurándose de evitar la capa leucocitaria) en tubos de 15 ml. Si e…

Discussion

VIH-1 en individuos infectados en el tratamiento antirretroviral combinado (TARC) o que, naturalmente, el control de la infección tienen cargas virales muy bajas, por lo general alrededor de 1 copia por mililitro de plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} La carga viral en pacientes con un control natural, a menudo fluctúan alrededor de un conjunto individual de ^{1, 2, 17.} La sensibilidad de los ensayos descritos en este documento depende en gran medida el volumen de entrada de plasma. En general, hemos estado …

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Random hexamers (500 ug/ml)	Promega	C118A
Taqman buffer A	Applied Biosystems	4304441
RNAsin (40 U/ul)	Promega	N211B
RT enzyme (200 U/ul)	Strategene	600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase	Applied Biosystems	4311814	6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X buffer	Invitrogen		comes with the enzyme
DTT 100 mM	Invitrogen		comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul	Invitrogen	11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer	Invitrogen	11304-102	comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml	Ambion	2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M	FlukaBiochemica	50983
Glycogen 20 mg/ml	Roche	10901393001
Isopropanol	Sigma-Aldrich	19516
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich	E702-3
Molecular grade water	Gibco/Invitrogen	10977-015
dNTPs (25 mmol each)	Bioline	BIO-39025

Name of Euipment	Company	Catalogue number	Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm)	Seaton Scientific	6041
White Delrin crowns	Seaton Scientific	4020	Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml	Beckman	361642
Hex driver ½ inc opening	Seaton Scientific	4013
cap removal tupe	Seaton Scientific	4014
5 ml serological pipettes	Costar	4051
Pipetboy	any
15 ml Transfer pipettes	ISC Bioexpress	P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip	VWR	14670-329
15 ml centrifuge tubes	Falcon
1 ml centrifuge tubes	any
Tris buffer Saline tablets	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor	Sorval	90SE and T-1270
96-well PCR plates	Biorad	HSS-9601
50 ml Reagent reservoir	Costar	4870
Microamp optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems	N801-0560
Optical plate covers	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp Optical Compression Pad	Applied Biosystems	4312639
Microseal A film	Biorad	MSA-5001
2 ml centrifuge tubes	Any
1% agarose gels (E-gel, invitrogen)	Invitrogen	G-7008-01
E-base (Invitrogen)	Invitrogen	EB-M03

EDTA Collection tubes any brand