Summary

Amplificazione e quantificazione di HIV-1 RNA in soggetti affetti da HIV con una carica virale inferiore il limite di rilevamento da parte di Standard saggi clinici

Published: September 26, 2011
doi:

Summary

Quantificare i livelli di HIV-1 RNA nel plasma e sequenziamento singolo HIV-1 genomi di individui con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità (50-75 copie / ml) è difficile. Qui si descrive come estrarre e quantificare l'RNA virale plasmatico usando un test PCR in tempo reale che misura affidabile HIV-1 RNA fino a 0,3 copie / ml e come amplificare genomi virali mediante sequenziamento del genoma unico, da campioni con una carica virale molto bassa.

Abstract

Amplificando i geni virali e la quantificazione di HIV-1 RNA di HIV-1 individui infetti con una carica virale al di sotto del limite di rilevabilità da test standard (sotto 50-75 copie / ml) è necessario per ottenere informazioni alla dinamica virale e le interazioni ospite del virus in pazienti che naturalmente controllare l'infezione e coloro che sono in terapia antiretrovirale combinata (CART).

Qui si descrivono come amplificare genomi virali da sequenziamento del genoma singolo (il protocollo SGS) 13, 19 e come quantificare con precisione HIV-1 RNA nei pazienti con bassa carica virale (la singola copia saggio (SCA) protocollo) 12, 20.

Il singolo-copia saggio è un real-time PCR con sensibilità a seconda del volume di plasma essere analizzati. Se un singolo genoma del virus viene rilevato in 7 ml di plasma, quindi il numero di copie di RNA è segnalato per essere 0,3 copie / ml. Il test è un test di controllo interno per l'efficienza di estrazione di RNA, e controlli per l'amplificazione del DNA o da possibili contaminazioni. I campioni dei pazienti sono misurati in triplice copia.

Il singolo test di sequenziamento del genoma (SGS), oggi largamente utilizzati e considerati non-lavoro intensivo 3, 7, 12, 14, 15, è un test di diluizione limite, in cui endpoint diluito prodotto cDNA si estende su una da 96 pozzetti piatto. Secondo una distribuzione di Poisson, quando meno di 1 / 3 dei pozzi danno prodotto, c'è una probabilità 80% della risultante prodotto di PCR è di amplificazione da una singola molecola di cDNA. SGS ha il vantaggio sulla clonazione di non essere sottoposto a ricampionamento e di non essere prevenuto mediante PCR-introdotto ricombinazione 19. Tuttavia, il successo di amplificazione di SCA e SGS dipendono dal disegno primer. Entrambi i saggi sono stati sviluppati per l'Hiv-1 sottotipo B, ma può essere adattato per altri sottotipi e in altre regioni del genoma di primer cambiando, sonde, e standard.

Protocol

1. Estrazione di RNA da grandi volumi di plasma Una panoramica dei test singola copia (SCA) e il singolo sequenziamento del genoma (SGS) protocollo sono forniti nelle figure 1 e 2. Per ottenere 7 ml di plasma, rotazione di circa 14 ml di sangue raccolte in 15 ml di EDTA (non eparina) tubi di raccolta a 2.600 xg per 15 minuti senza freni. Pipettare plasma (avendo cura di evitare lo strato del buffy coat) in provette da 15 ml. Se l'RNA è stato estratto per il saggio s…

Discussion

HIV-1 individui infetti in trattamento antiretrovirale combinata (CART) o che naturalmente controllare l'infezione hanno carica virale molto bassa, in genere circa 1 copia per ml di plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carica virale nei pazienti con controllo naturale, spesso oscillare intorno ad un singolo set di punto 1, 2, 17. La sensibilità del test è descritto nel presente documento dipende in larga misura il volume di ingresso di plasma. In generale, abbiamo lavorato con 7 ml di plasma, ma i risul…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare i pazienti che hanno partecipato a numerosi studi di HIV-1.

JMC era un professore di ricerca della American Cancer Society con il sostegno della Fondazione FM Kirby.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega C118A  
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441  
RNAsin (40 U/ul) Promega N211B  
RT enzyme (200 U/ul) Strategene 600107-51  
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G  
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044  
Superscript III 10X buffer Invitrogen   comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen   comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102  
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546  
Guanidinium Thiocyanate solution 6M FlukaBiochemica 50983  
Glycogen 20 mg/ml Roche 10901393001  
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516  
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3  
Molecular grade water Gibco/Invitrogen 10977-015  
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025  
Name of Euipment Company Catalogue number Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041  
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman 361642  
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013  
cap removal tupe Seaton Scientific 4014  
5 ml serological pipettes Costar 4051  
Pipetboy any    
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7  
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR 14670-329  
15 ml centrifuge tubes Falcon    
1 ml centrifuge tubes any    
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB  
Ultracentrifuge and rotor Sorval 90SE and T-1270  
96-well PCR plates Biorad HSS-9601  
50 ml Reagent reservoir Costar 4870  
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560  
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183  
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639  
Microseal A film Biorad MSA-5001  
2 ml centrifuge tubes Any    
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01  
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03  

EDTA Collection tubes any brand

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

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