Pyrophosphates Inositol jouer un rôle important dans les pathologies humaines telles le cancer, le diabète et l'obésité; cependant, le mécanisme d'action exact est un sujet de litige. Le manque de commerce pyrophosphates inositol rend études détaillées problématique. Nous décrivons ici un protocole simple de produire et d'isoler milligrammes de pyrophosphates inositol.
Myo-inositol est présent dans la nature soit intact ou en plus complexes dérivés phosphorylés. De la dernière, les deux plus abondants dans les cellules eucaryotes sont pentakisphosphate inositol (IP 5) et hexakisphosphate inositol (acide phytique ou IP 6). IP 5 et 6 du protocole IP sont les précurseurs des molécules qui contiennent pyrophosphate inositol une ou plusieurs liaisons pyrophosphates 1. La phosphorylation de propriété intellectuelle génère six diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 ou PP-PI 5) et bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate IP (8 ou (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates inositol ont été isolées de tous les organismes eucaryotes étudiées jusqu'ici. En outre, les deux classes distinctes d'enzymes responsables de la synthèse du pyrophosphate inositol sont très conservés au cours de l'évolution 2-4.
Le 6 IP kinases (IP 6 Ks) possèdent une énorme flexibilité catalytique, la conversion IP et IP 5 6 PP-PI 4 et 7, respectivement IP et ensuite, en utilisant ces produits comme substrats, promouvoir la production de molécules plus complexes 5,6 . Récemment, une deuxième classe d'enzymes générant pyrophosphate a été identifié dans la forme de la protéine de levure VIP 1 (aussi appelé le PP-PI 5 K), qui est capable de convertir IP à IP 6 7 8 7,8 et IP.
Pyrophosphates Inositol réguler de nombreux processus cellulaires disparates tels que 9 sécrétion d'insuline, la longueur des télomères 10,11, 12 chimiotactisme, le trafic vésiculaire 13, 14 homéostasie du phosphate et du VIH-1 gag communiqué 15. Deux mécanismes d'actions ont été proposées pour cette classe de molécules. Ils peuvent affecter la fonction cellulaire par allostériquement interagissant avec des protéines spécifiques comme AKT 16. Alternativement, le groupe pyrophosphate pouvez faire un don d'un phosphate de pré-phosphorylée protéines 17. L'énorme potentiel de ce domaine de recherche est entravée par l'absence d'une source commerciale de pyrophosphates inositol, qui empêche de nombreux scientifiques de l'étude de ces molécules et cette nouvelle modification post-traductionnelle. Les méthodes actuellement disponibles pour isoler les pyrophosphates inositol nécessitent sophistiqués appareil chromatographique 18,19. Ces procédures utilisent des conditions acides qui pourraient conduire à la dégradation de l'inositol pyrophosphate 20 et donc à une mauvaise récupération. Par ailleurs, la lourdeur des procédures dessalage post-colonne de restreindre leur utilisation à des laboratoires spécialisés.
Dans cette étude, nous décrivons une méthode peu exigeante pour la génération, l'isolement et la purification des produits de l'IP 6-kinase et PP-PI-5 kinases réactions. Cette méthode a été possible par la capacité de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour résoudre hautement phosphorylée polyphosphates inositol 20. Suite à IP 6 K1 et PP-PI 5 réactions enzymatiques en utilisant K 6 IP comme substrat, PAGE a été utilisé pour séparer les pyrophosphates généré inositol qui ont été ensuite élue à l'eau.
L'utilisation de pyrophosphate inositol en biochimie est sévèrement limitée par l'indisponibilité commerciale de ces composés et la faible sensibilité des méthodes de détection existantes. La combinaison de la page, qui permet la séparation de molécules possédant un nombre différent de groupes phosphate, et bleu de toluidine (figure 1), un colorant métachromatique qui se lie à des groupes phosphate, permet la détection facile des isoformes pyrophoshate inositol ouvrir de nouvelles avenues de recherche 20.
L'utilisation de la technologie décrite PAGE pour purifier les produits pyrophosphate inositol de la réaction enzymatique réalisée outby soit 6 IP K1 ou VIP1 est une méthode simple, économique et fiable qui permet la production de grandes quantités d'IP de haute qualité 7. La méthode décrite ci-dessus n'est pas limitée à la simple purification de la PI 7, mais de légères modifications du protocole décrit peut permettre la purification d'une gamme différente de pyrophosphates inositol. Supérieur phosphorylée isoformes pyrophosphate inositol, contenant plus de huit groupes de phosphate peuvent être détectées en utilisant l'IP 7 ou différents montants de 6 IP comme substrat 20,6. Ces pyrophosphates inositol peut être détecté en augmentant la longueur de la procédure de coloration et ensuite purifié (section 3.2). Par ailleurs, l'utilisation de 5 IP comme substrat pour la réaction enzymatique permettant la purification de la PP-PI 5 et d'autres pyrophosphates inositol contenant un groupe hydroxyle sur le cycle inositol.
En conclusion, cette méthode permet peu exigeante pour la purification de quantités fiables milligramme de pyrophosphates inositol avec des instruments largement disponibles, ouvrant ainsi de nouvelles avenues pour ce domaine de recherche passionnant.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions A. Riccio pour leurs commentaires et de lire le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council (MRC) de financement à l'Unité de Biologie cellulaire et par un homme Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |