Inositol Pyrophosphate spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit, jedoch ist der genaue Wirkungsmechanismus umstritten. Das Fehlen von kommerziell erhältlichen Inosit Pyrophosphate macht detaillierte Studien problematisch. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, zu produzieren und zu isolieren Milligramm Inosit Pyrophosphate.
Myo-Inosit kommt in der Natur entweder unverändert oder in komplexer phosphorylierte Derivate. Von den neuesten, sind die beiden häufigsten in eukaryotischen Zellen Inosit pentakisphosphate (IP 5) und Inositol hexakisphosphate (Phytinsäure oder IP 6). IP 5 und IP 6 sind die Vorläufer von Inositol Pyrophosphat-Moleküle, die einen oder mehrere Pyrophosphat-Bindungen 1 enthalten. Die Phosphorylierung von IP 6 erzeugt diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 oder PP-IP 5) und bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 oder (PP) 2-IP 4). Inositol Pyrophosphate wurden aus allen eukaryotischen Organismen so weit untersucht wurde isoliert. Darüber hinaus sind die zwei verschiedene Klassen von Enzymen verantwortlich für Inosit Pyrophosphat-Synthese hoch im Laufe der Evolution 2-4 konserviert.
Die IP 6-Kinasen (IP 6 Ks) besitzen eine enorme katalytische Flexibilität, Konvertieren IP 5 und IP 6 bis PP-IP 4 und IP 7 bzw. und anschließend durch die Verwendung dieser Produkte als Substrate, die Förderung der Erzeugung von komplexen Molekülen 5,6 . Kürzlich wurde eine zweite Klasse von Pyrophosphat erzeugende Enzyme in Form der Hefe-Protein VIP 1 (auch als PP-IP 5 K genannt), die in der Lage, IP 6 bis IP 7 und IP 8 7,8 konvertieren identifiziert wird.
Inositol Pyrophosphate regulieren viele disparate zellulären Prozessen wie Insulinsekretion 9, Telomerlänge 10,11, Chemotaxis 12, vesikuläre Menschenhandel 13, Phosphat-Homöostase 14 und HIV-1 gag Release 15. Zwei Mechanismen der Aktionen haben für diese Klasse von Molekülen, vorgeschlagen worden. Sie können zelluläre Funktion von allosterisch die Interaktion mit bestimmten Proteinen wie AKT 16 beeinflussen. Alternativ kann der Pyrophosphat-Gruppe eine Phosphat vor, phosphorylierter Proteine 17 spenden. Das enorme Potenzial dieses Forschungsgebiets ist durch das Fehlen einer kommerziellen Quelle von Inositol Pyrophosphate, die verhindern, viele Wissenschaftler ist durch das Studium dieser Moleküle und diese neue post-translationale Modifikation behindert. Die derzeit verfügbaren Methoden zur Inositol Pyrophosphate isolieren erfordern anspruchsvolle chromatographische Apparatur 18,19. Diese Verfahren nutzen sauren Bedingungen, die zu Inositol Pyrophosphat Abbau 20 und damit zu einer schlechten Erholung führen kann. Außerdem schränken die umständliche Post-Säule entsalzt Verfahren ihrer Verwendung zu spezialisierten Laboratorien.
In dieser Studie beschreiben wir eine anspruchslose Methode für die Erzeugung, Isolierung und Aufreinigung der Produkte der IP 6-Kinase-und PP-IP 5-Kinasen Reaktionen. Diese Methode wurde von der Fähigkeit der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) zu lösen hochphosphorylierte Inositol Polyphosphate 20 möglich. Nach IP 6 K1 und PP-IP 5 K enzymatischen Reaktionen mittels IP 6 als Substrat wurde PAGE verwendet, um die erzeugte Inosit Pyrophosphate, die anschließend in Wasser eluiert trennen.
Die Verwendung von Inositol Pyrophosphat in der Biochemie ist stark von der kommerziellen Nichtverfügbarkeit solcher Verbindungen und die geringe Empfindlichkeit des vorhandenen Nachweismethoden begrenzt. Die Kombination von PAGE, die die Trennung von Molekülen, die unterschiedliche Anzahl von Phosphatgruppen, und Toluidinblau (Abbildung 1), einem metachromatischen Farbstoff, der Phosphat-Gruppen bindet, ermöglicht es ermöglicht die einfache Erfassung von Inositol pyrophoshate Isoformen der Eröffnung neuer Wege in der Forschung 20.
Die beschriebene Verwendung von PAGE-Technologie in Inositol Pyrophosphat Produkte der enzymatischen Reaktion zu reinigen durchgeführt outby entweder IP 6 K1 oder VIP1 ist eine einfache, wirtschaftliche und zuverlässige Methode, die für die Herstellung großer Mengen von hoher Qualität IP 7 ermöglicht. Das oben beschriebene Verfahren ist nicht auf die einfache Reinigung von IP 7, aber begrenzte geringfügige Modifikationen der beschriebenen Protokoll kann die Reinigung von einem anderen Bereich von Inositol Pyrophosphate ermöglichen. Höhere phosphorylierte Inosit Pyrophosphat Isoformen, mit mehr als acht Phosphat-Gruppen mehr nachweisbar mit IP 7 oder unterschiedliche Mengen an IP 6 als Substrat 20,6 sein. Diese Inosit Pyrophosphate kann durch Erhöhung der Länge der Färbung und anschließend gereinigt (Abschnitt 3.2) nachgewiesen werden. Außerdem würde die Verwendung von IP 5 als Substrat für die enzymatische Reaktion zu ermöglichen die Reinigung von PP-IP 5 und andere Inosit Pyrophosphate mit einer Hydroxylgruppe am Inositolring.
Im Ergebnis ermöglicht diese anspruchslose Methode für die zuverlässige Reinigung von Milligramm-Mengen von Inositol Pyrophosphate mit weit verfügbaren Instrumente und eröffnet damit neue Wege für dieses spannende Forschungsfeld.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken A. Riccio für hilfreiche Kommentare und das Manuskript zu lesen. Diese Arbeit wurde von der Medical Research Council (MRC) die Finanzierung auf den Cell Biology Unit und durch eine Human Frontier Science Program Grant (RGP0048/2009-C) unterstützt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |