イノシトールピロリン酸は人間の病態、例えば癌、糖尿病や肥満の重要な役割を果たしているが、作用の正確なメカニズムは、紛争の問題です。市販のイノシトールピロリン酸の不足は、詳細な研究が問題とレンダリング。ここでは、イノシトールピロリン酸のミリグラムを生成し、分離するために単純なプロトコルを記述する。
ミオイノシトールは、修正されていないか、より複雑なリン酸化誘導体のいずれかに自然に存在しています。最新の、真核細胞の中で最も豊富な二人はイノシトールpentakisphosphate(IP 3)とイノシトール六リン酸(フィチン酸またはIP 6)です。 IP 5とIP 6は、1つまたは複数のピロリン酸結合1を含むイノシトールピロリン酸の分子の前駆体である。 IP 6のリン酸化がdiphoshoinositolpentakisphosphate(IP 7またはPP – IP 5)及びbisdiphoshoinositoltetrakisphosphate(IP 8または(PP)2 – IP 4)を生成します。イノシトールピロリン酸塩は、これまでに学んだすべての真核生物から単離されている。さらに、イノシトールピロリン酸の合成を担う酵素の2つの別個のクラスは、高度に進化2月4日にわたって保存されている。
IP 6キナーゼ(IP 6 KS)保有基質として、これらの製品を使用することにより、それぞれ、その後IP 5、PP – IP 4、IP〜7 IP 6を変換する巨大な触媒柔軟性は、より複雑な分子5,6の生成を促進する。最近、酵素を生成するピロリン酸第二のクラスは、IP 7やIP 8 7,8にIP 6を変換することができる酵母タンパク質VIP 1(また、PP – IP 5 Kと呼ぶ)、の形で同定された。
イノシトールピロリン酸は、インスリンの分泌9、テロメアの長さ10,11、走化性12、小胞輸送13、リン酸の恒常性14およびHIV – 1のgagリリース15として、多くの異なる細胞プロセスを調節する。アクションの2つのメカニズムが分子のこのクラスのために提案されている。彼らは、アロステリックAKT 16のような特定の蛋白質と相互作用することにより細胞機能に影響を与える可能性があります。また、ピロリン酸基は、事前にリン酸化タンパク質17にリン酸を寄付することができます。この研究分野の大きな潜在力は、これらの分子の研究から多くの科学者を妨げているイノシトールピロリン酸の商業的供給源、およびこの新しい翻訳後修飾の欠如によって妨げられている。イノシトールピロリン酸塩を分離するために現在利用可能なメソッドは、洗練されたクロマトグラフ装置18,19が必要です。これらの手順は、イノシトールピロリン酸の分解20とこうして貧しい回復につながる可能性のある酸性条件を使用してください。さらに、面倒なポストカラムの脱塩の手続きは専門の研究所にその使用を制限する。
本研究では、IP 6 -キナーゼとPP – IP 5 -キナーゼ反応の生成物の生成、単離および精製の ための多くを求めない方法を説明します。このメソッドは、高度にリン酸化されたイノシトールポリリン酸20を解決するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)の能力によって可能であった。 IP 6 K1と基質としてのIP 6を使用してPP – IP 5 Kの酵素反応に続いて、PAGE、続いて水で溶出し、生成されたイノシトールピロリン酸塩を分離するために使用されていました。
生化学におけるイノシトールピロリン酸の使用は厳しく、このような化合物の商業利用できないと、既存の検出方法の乏しい感度によって制限されます。異なるリン酸基の数、およびトルイジンブルー( 図1)、リン酸基に結合する異染染料を、有する分子の分離を可能にするページ、の組み合わせは、研究20の新たな道を開くイノシトールpyrophoshateのアイソフォームの容易な検出を行うことができます。
酵素反応のイノシトールピロリン酸の製品を精製するためにこのページの技術を説明する使用はoutbyどちらIP 6 K1またはVIP1を行い、高品質のIP 7の大量の生産を可能にするシンプルで、経済的かつ信頼性の高い方法です。上記の方法は、7 IPの簡易精製法に限定されるものではなく、記述されたプロトコルのマイナーな修正は、イノシトールピロリン酸の異なる範囲の精製を可能にすることができる。個以上のリン酸基を含む高リン酸化イノシトールピロリン酸のアイソフォームは、基板20,6として、IP 7またはIP 6の異なる量を用いて検出することができる。これらのイノシトールピロリン酸は、染色手順の長さを増加させ、続いて(セクション3.2)、精製によって検出することができます。また、酵素反応の基質としてIP 5の使用は、PP – IP 5の精製とイノシトール環に ヒドロキシル基を含む他のイノシトールピロリン酸塩をできるようになります。
結論として、この多くを求めない方法は、このように、このエキサイティングな研究分野のための新しい道を開いて、広く利用可能な楽器とイノシトールピロリン酸のミリグラム単位の信頼性の高い精製が可能になります。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、有益なコメントをA. Riccioのを感謝し、原稿を読み取るために。この作品は、細胞生物学ユニットの医学研究評議会(MRC)の資金によって、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのグラント(RGP0048/2009-C)によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |