이노시톨 pyrophosphates 인간 pathologies에 중요한 역할 등 암, 당뇨병과 비만을 재생할 수 있지만, 행동의 정확한 메커니즘은 분쟁의 문제입니다. 상용 이노시톨 pyrophosphates의 부족 상세한 연구는 렌더링 문제. 여기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램을 생산하고 격리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
묘 – 이노시톨도 수정되지 않은 자연의 이상의 복잡한 phosphorylated derivates에 속해 있습니다. 최신, 진핵 세포에서 가장 풍부한 두 사람은 이노시톨 pentakisphosphate IP (5)과 이노시톨 hexakisphosphate (phytic 산성 또는 IP 6)입니다. IP 5 IP 6 하나 이상의 나트륨 채권 하나를 포함 이노시톨 나트륨 분자의 엽 성의 전구 물질입니다. IP 6 인산화은 diphoshoinositolpentakisphosphate IP (7 PP – IP 5) 및 bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP 8 (PP) 2 – IP 4) 생성합니다. 이노시톨 pyrophosphates는 지금까지 공부를 모든 진핵 생물에서 고립되어있다. 또한, 이노시톨 나트륨 합성에 대한 책임 효소의 두 개의 클래스는 매우 진화 2-4 걸쳐 보존되어 있습니다.
IP 6 kinases (IP 6 KS) posses 거대한 촉매 유연성, 5 IP와 PP – IP 4 각각 IP 7 IP 6 이후, 기판 이러한 제품을 사용하여 더 복잡한 분자의 생성 5,6을 촉진 변환 . 최근 나트륨 생성 효소의 두 번째 클래스는 IP 7 8 7,8 IP에 IP 6 변환할 수있는 효모 단백질 VIP 1의 양식 (도 PP – IP 5 K로 함)에서 확인되었다.
이노시톨 pyrophosphates는 인슐린 분비 9, telomere의 길이 10,11, chemotaxis 12 소낭성의 인신 매매 13, 인산 항상성 14 HIV – 1 개그 출시 15 여러 이질적인 세포 과정을 조절. 동작의 두 가지 메커니즘이 분자의 클래스에 대한 제안되었습니다. 그들은 allosterically AKT 16과 같은 특정 단백질과 상호 작용하여 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 또는 나트륨 그룹은 사전 phosphorylated 단백질 17 인산염을 기부하실 수 있습니다. 이 연구 분야의 무한한 잠재력은 이러한 분자이 새 게시물 – translational 수정을 공부하고 많은 과학자를 방해 이노시톨 pyrophosphates의 상용 소스의 부재에 의해 방해합니다. 이노시톨 pyrophosphates을 분리하기 위해 현재 사용할 수있는 방법은 복잡한 색층 장치 18,19 필요합니다. 이러한 절차는 이노시톨 나트륨 저하 20 그러므로 가난한 회복으로 이어질 수 산성 조건을 사용합니다. 또한, 성가신 포스트 컬럼 탈염 절차는 전문 실험실 그들의 사용을 제한할 수 있습니다.
본 연구에서는 우리는 IP 6 키나제와 PP – IP 5 kinases 반응의 제품의 생성, 절연 및 정화를위한 undemanding 방법을 설명합니다. 이 방법은 매우 phosphorylated 이노시톨 polyphosphates 20를 해결하기 위해 polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE)의 능력에 의해 가능했다. IP 6 K1과 기판과 같은 IP 6을 사용 PP – IP 5 K 효소 반응에 따라, 페이지는 이후 물에 eluted 있던 생성 이노시톨 pyrophosphates를 구분하는 데 사용되었다.
생화학에서 이노시톨 나트륨의 사용은 심각하게 이러한 화합물의 상업 unavailability와 기존의 검색 방법의 가난한 감도에 의해 제한됩니다. 다른 인산염 그룹의 번호, Toluidine 블루 (그림 1), 인산염 그룹에 바인딩 metachromatic 염료를 가진 분자의 분리를 가능하게 페이지의 결합 연구 20 새로운 길을 여는 이노시톨 pyrophoshate의 isoforms의 쉬운 검색이 가능합니다.
효소 반응의 이노시톨 나트륨 제품을 정화 페이지 기술의 설명 사용 IP 6 K1이나 VIP1 하나 고품질의 IP 7 다량의 생산을 허용 간단, 경제적 안정 방법입니다 outby 실시. 위에서 설명한 방법은 7 IP의 간단한 정화에 국한되지 않습니다하지만 설명 프로토콜의 사소한 수정 이노시톨 pyrophosphates의 다른 범위의 정화를 허용할 수 있습니다. 이상의 여덟 인산염 그룹을 포함하는 높은 phosphorylated 이노시톨 나트륨의 isoforms은 기판 20,6로 IP 7 IP 6 다른 양의를 사용하여 검색하실 수 있습니다. 이러한 이노시톨 pyrophosphates은 얼룩 절차의 길이를 증가하고 이후 (3.2) 정화에 의해 감지하실 수 있습니다. 또한, 효소 반응을위한 기판으로 IP 5 사용 PP – IP 5 정화 및 이노시톨 고리에 수산기 그룹을 포함하는 다른 이노시톨 pyrophosphates을 허용합니다.
결론적으로,이 undemanding 방법은 이처럼 흥미로운 연구 분야에 대한 새로운 길을 열어, 널리 사용 악기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램 수량의 안정적인 정화를 위해 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 도움이 덧글에 대한 A. 이럴 감사하고 원고를 읽을 수 있습니다. 이 작품은 셀 단위로 생물 의학 연구위원회 (MRC) 기금에 의해 그리고 인간 프론티어 과학 프로그램 그랜트 (RGP0048/2009-C)에 의해 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Phytic Acid (IP6) | Sigma-Aldrich | P8810 |
Poly-P (sodium hexametaphosphate) | Sigma-Aldrich | P8510 |
ATP-Mg2+ salt | Sigma-Aldrich | A9187 |
OrangeG | Sigma-Aldrich | O3756 |
PhosphoCreatine (PCr) | Sigma-Aldrich | P7936 |
CreatinePhospho Kinase (CPK) | Sigma-Aldrich | C3755 |
GST-Vip1 | 17 | 17 |
His-IP6K1 | 18 | 18 |
His-Ddp1 | Available in lab | Available in lab |
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%) | Flowgen | H16972 |
Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A9164 |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Sigma-Aldrich | T 9060 |
Temed | BDH | 43083G |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 198161 |
SpeedVac | Christ | 100218 |
Gel apparatus | Hoefer | SE600 |
Vacuum manifold | Christ | Alpha 2-4 |
Vacuum pump | ABM Greiffenberger | 4EKF63CX |