Подготовка Качество Инозитол пирофосфаты

Summary

Инозитол пирофосфаты играют важную роль в человеческой патологии, такие рака, диабета и ожирения, однако точный механизм действия является предметом спора. Отсутствие коммерчески доступных инозитол пирофосфаты предоставляет детальные исследования проблематично. Здесь мы опишем простой протокол для производства и изолировать мг инозитол пирофосфаты.

Abstract

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP₅) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP₆). IP₅ and IP₆ are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds¹. Phosphorylation of IP₆ generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP₇ or PP-IP₅) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP₈ or (PP)₂-IP₄). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution^2-4.

The IP₆ kinases (IP₆Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP₅ and IP₆ to PP-IP₄ and IP₇ respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules^5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP₁ (also referred as PP-IP₅K), which is able to convert IP₆ to IP₇ and IP₈^7,8.

Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion⁹, telomere length^10,11, chemotaxis¹², vesicular trafficking¹³, phosphate homeostasis¹⁴ and HIV-1 gag release¹⁵. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT¹⁶. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins¹⁷. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus^18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation²⁰ and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.

In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP₆-kinase and PP-IP₅-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates²⁰. Following IP₆K1 and PP-IP₅K enzymatic reactions using IP₆ as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Protocol

1. Ферментативной реакции – день 1 (1 час в день) Первый шаг заключается в подготовке 10-20 независимых ферментативных реакций, в которых ИП 6 K1 или VIP1 преобразования IP 6 до pyrophosphorylated изоформ. Мы используем его IP-6 К1 и GST-VIP1 ферментов, очищенный от E. палочки в соответствии с протоколом описано выше 17,18. Подготовка 50 мкл реакции, содержащие 1X реакционного буфера (30 мМ Hepes рН 6,8, 50 мМ NaCl, 6 мМ MgSO 4, 1 мМ DTT), 6 мм фосфокреатина (ПЦР), 25 ед / мл CreatinePhosphoKinase (КФК), 5 мМ АТФ (Mg соли), 0,3 мМ IP6, 0,05-0,1 мкг Его-IP 6 K1 или GST-VIP1. Регулировка громкости с MiliQ DDH 2 O. Кратко спина реакции и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи с вращением. 2. Полиакриламидном геле литья и погрузка – 2-й день (4 часа в день) Полиакриламидном геле подготовлен с использованием 24 см в длину, 18 см шириной пластин стекла и 1,5 мм шириной прокладки. Обычно 16 полосы или препаративной одной гребенкой переулок используется. Подготовка смеси (50 мл / гель), содержащий следующие: 35,5% (м / о) акриламид: бис-акриламид 19:1, 1X Трис / Борат / EDTA (КЭ), 0,05% (м / о) персульфата аммония (APS ), 0,05% (м / о) Temed. Вылейте смесь предварительно литых стеклянных пластин, вставьте расческу и пусть полимеризоваться в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Как только гель полимеризуется, передачу аппарата для холодной комнате и предварительно запустить в 1X TBE около 30-60 минут при 200-300 вольт. Добавить 1X из OrangeG красителя (10 мМ Трис-HCl pH7.0, 1 мМ ЭДТА, 30% глицерина, 0,1% OrangeG) для каждой реакции. Подготовка образцов, содержащих 2 нмоль ИП 6 для загрузки в качестве стандартного контроля. Промыть каждую лунку тщательно проточной буфера с помощью шприца и иглы 21G, чтобы удалить осадок, а затем загрузить геля. Избегайте нагрузки на стороне скважин. Выполнить геля в течение ночи при 450-550 Вольт (7 MAMP / гель), пока OrangeG группы красителя в течение последних 10 см от нижней части геля. 3. Выделение IP-7 – день 3 (4 часа) и 4-й день (6-7 часа SpeedVac процесса сушки) Разберите гель аппарата и аккуратно удалить одну стеклянную пластину оставив гель на другую. Cut небольшая часть геля от чуть выше OrangeG группы красителя на дно содержащие ИП 6 стандартных и один образец полосы, как показано на рисунке 1. Пятно вырезать часть геля толуидиновым синим (0,1% (м / о) толуидиновым синим, 20% (м / о) метанола, 2% (вес / объем) глицерин) в течение нескольких минут (1-3 мин) или до инозитол группы пирофосфат появляется. Поместите стеклянную пластинку ранее удалили обратно поверх геля для предотвращения неокрашенных гель от высыхания. ИП 7 полоса должна быть видна, поскольку она работает немного медленнее, чем ИП 6 стандарта. АТФ, который работает быстрее, чем IP-6, также должны быть видны (рис. 1). Передача окрашенные части геля в де-красящим раствором (20% (м / о) метанол) в течение нескольких минут, смыть любое превышение толуидиновым синим и переместить гель с неокрашенными геля. Если визуализация выше pyrophosphorylated инозитол изоформ (IP-8 и IP-9) не требуется, пятно гель с Толуидин решение окрашивания синий в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем смыть толуидин синий с де-красящим раствором в течение приблизительно 15 минут. С лезвием бритвы вырезать IP 7-ми полосный на неокрашенных часть геля, используя в качестве ссылки ИП 7 миграции положение определяется с окрашенных гель (рис. 1). Положите ИП 7 группа, которая была вырезана из геля на 15 мл трубки и добавить 10 мл MilliQ DDH 2 O. Положите труб в ротации в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите жидкость для удаления избытка КЭ и микроскопических частиц акриламида. Впоследствии, выполняют две дегидратации-гидратации циклов. Добавьте 5 мл 50% (м / о) метанола в трубку с гелем, содержащим IP-7 и вращаются при комнатной температуре в течение 2 часов. Передача геля для новых 15 мл пробирку, содержащую 5 мл MilliQ DDH 2 O и вращаться при комнатной температуре в течение 2 часов. Не выбрасывайте метанола и MilliQ H 2 O из труб. Повторите дегидратации-гидратации цикл еще раз, повторно передачи полиакриламидном геле в 15 мл трубы использовались ранее. Один из моющие средства могут быть выполнены в течение ночи. Чтобы сосредоточиться элюировали ИП 7, сухой 10 мл вместе (5 мл MilliQddH 2 O и 5 мл 50% (м / о) метанола) с использованием SpeedVac нагревают при 60 ° C. Как только образцы почти сухая, передача оставшейся жидкости (300-600 мкл) к A1.5 мл центрифужную пробирку и спина в течение 2 минут при 5000 оборотах в минуту. Сбор супернатант и передачи в свежем 1,5 мл центрифужную пробирку, оставьтенижняя 20-30 мкл, поскольку она может содержать акриламида частиц. При необходимости продолжить процесс сушки использованием неотапливаемых SpeedVac. Восстановление ИП 7 значительно сокращается, если образцы полностью высохнуть, поэтому прекращать процесс сушки, когда образцы достигают объема 100-300 мкл. 4. Определение IP 7 концентрации и чистоты. Используйте 2-5 мкл восстановленного ИП 7 образца для работы на PAGE гель, как и в разделах 2.2-2.5. Загрузите несколько разведений ИП 6 (0,5 т., 1, 2, 4 нмоль) в стандартной концентрации и 4 нмоль Поли-Р маркером. После запуска гель, визуализировать инозитол изоформ пирофосфат окрашиванием и де-окрашивание весь гель с толуидиновым синим решение, согласно процедуре, описанной в разделе 3.2 (рис. 2А). После Толуидин окрашивания, концентрация может быть определена путем сканирования геля и сравнение различий в интенсивности между IP-6 и IP-7 с помощью обработки изображений, такие как изображения-J, как показано на рисунке 2Б. 5. Представитель Результаты: Препаративного ферментативного превращения IP 6 до 7 с помощью IP-IP ферменты 6 К1 и VIP1 можно легко разрешить с помощью PAGE анализа (рис. 1). Загрузка IP-6, как размер контроля совместно с Толуидин окрашивания геля Синий позволяет идентифицировать pyrophosphorylated производные, так как они работают медленнее, в зависимости от количества фосфатных групп, присутствующих на инозитол кольцо. Процедура, описанная выше, позволяет легко очистки IP 7. Анализ очищенной инозитол пирофосфат за страницей показал чистоту нашего IP-7 (рис. 2а). Интересно, что 1/3PP-IP 5 изомер ИП 7 продуктом VIP1 мигрирует немного медленнее, чем 5PP-IP 5 изомер ИП 7, порожденный IP 6 К1. Использование IP 6 стандартов разрешения легко количественная концентрация очищенного IP-7 (рис. 2Б). Перед использованием IP-7 для дальнейших экспериментов, его биологическая активность может быть оценен (Рис. 3). 5PP-IP 5 инкубируют с VIP1 и с ИП 7 фосфатазы DDP1 (diphosphoinositol полифосфат phosphohydrolase). Регулярно, очищенный ИП 7 преобразуется в IP-8, VIP1 и ИП 6 по DDP1 (рис. 3). Рисунок 1:. Толуидин окрашивание СТРАНИЦА и выделение IP-7-ми полосный часть геля, содержащего стандартные (IP-6) был вырезан и окрашивали толуидин синий раствор. Три полосы представляют (сверху вниз) IP-7, ИП 6 и АТФ. Окрашенных часть геля затем выравнивается с остальными геля. Это позволяет локализация часть геля, содержащего IP-7, которые затем можно вырезать и очищенные (пунктирная коробка). Рисунок 2: СТРАНИЦА анализ IP реакции 6 К1 и VIP1 продукции. ) Анализ IP-6 (4, 2, 1, 0,5 нмоль) по толуидиновым синим окрашивания был использован для того, чтобы определить IP 7 Концентрация очищенного от обоих ИП 6 К1 (5PP-IP 5) и VIP1 (1/3PP-IP 5) реакций. B) анализ Scatter заговор с целью определения концентрации очищенных IP 7. Концентрации определялись по интенсивности полосы, рассчитанной с использованием программного обеспечения ImageJ, по сравнению с заранее определенным количеством IP-6. X-ось представляет интенсивность, Y-ось представляет концентрации выражены в нмоль. Рисунок 3. Анализ ИП 7 биологическую активность Для определения качества очищенной ИП 7 мы инкубировали 5PP-IP 5 (ИП 6 К1 порожденных IP-7) с VIP1 или с ИП 7 фосфатазы DDP1, а затем решил реакция на странице. DAPI и Толуидин окрашивание показало, ожидается производство IP-8, VIP1 и преобразование IP-7 по IP-6, DDP1.

Discussion

Использование инозитол пирофосфата в биохимии сильно ограничена коммерческой отсутствия таких соединений и низкой чувствительности существующих методов обнаружения. Сочетание PAGE, который позволяет разделение молекул, имеющих разное количество фосфатных групп, и толуидиновым синим (рис. 1), метахроматическая краситель, который связывается с фосфатными группами, позволяет легко обнаружения инозитол изоформ pyrophoshate открывая новые направления исследований ^20.

Описано использование технологии СТРАНИЦА, чтобы очистить инозитол продуктов пирофосфат ферментативной реакции осуществляется outby либо ИП ₆ K1 или VIP1 это простой, экономичный и надежный метод, который позволяет для производства большого количества высоких IP качества _7. Описанный выше метод не ограничивается простой очистки _IP-7, но незначительные изменения описанного протокола может позволить очистки различный диапазон инозитол пирофосфаты. Высшее фосфорилированных инозитол изоформ пирофосфат, содержащие более восьми фосфатные группы могут быть обнаружены с помощью _IP-7 или различное количество _{IP-6 в} качестве подложки ^20,6. Эти инозитол пирофосфаты могут быть обнаружены путем увеличения длины Процедура окраски, а затем очищенный (раздел 3.2). Более того, использование _{IP-5 в} качестве субстрата для ферментативной реакции позволит очистки _PP-IP-5 и других инозитол пирофосфаты содержащие гидроксильные группы по инозитол кольцо.

В заключение этого нетребовательного метод позволяет надежной очистки миллиграмм количествах инозитол пирофосфаты с широко доступных инструментов, тем самым открывая новые перспективы для этой захватывающей области исследований.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Phytic Acid (IP6)	Sigma-Aldrich	P8810
Poly-P (sodium hexametaphosphate)	Sigma-Aldrich	P8510
ATP-Mg2+ salt	Sigma-Aldrich	A9187
OrangeG	Sigma-Aldrich	O3756
PhosphoCreatine (PCr)	Sigma-Aldrich	P7936
CreatinePhospho Kinase (CPK)	Sigma-Aldrich	C3755
GST-Vip1	17	17
His-IP6K1	18	18
His-Ddp1	Available in lab	Available in lab
Acrylamide:Bis-Acrylamide 19:1 (40%)	Flowgen	H16972
Ammonium Persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A9164
Tris/Borate/EDTA (TBE)	Sigma-Aldrich	T 9060
Temed	BDH	43083G
Toluidine Blue	Sigma-Aldrich	198161
SpeedVac	Christ	100218
Gel apparatus	Hoefer	SE600
Vacuum manifold	Christ	Alpha 2-4
Vacuum pump	ABM Greiffenberger	4EKF63CX