Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia
Summary
Um<em> In vivo</em> Imagem de protocolo para monitor principal axônios sensitivos seguintes esmagar raiz dorsal é descrito. Utilizar os procedimentos de campo amplo de microscopia de fluorescência e thy1-YFP camundongos transgênicos, e permitir que imagens repetidas de regeneração de axônios mais de 4 cm no PNS e interações com a interface do axônio do SNC.
Abstract
Os axônios sensoriais primárias feridos por lesões de raízes nervosas não conseguem regenerar na medula espinhal, levando à dor crônica e perda sensorial permanente. Regeneração da raiz dorsal (DR) em axônios da medula espinhal é impedido na raiz dorsal entrada de zona (DREZ), a interface entre o CNS e PNS. Nossa compreensão dos eventos moleculares e celulares que impedem a regeneração em DREZ está incompleto, em parte porque as mudanças complexas associadas a lesão do nervo ter sido deduzida a partir de análises pós-morte. Dinâmicos processos celulares, tais como a regeneração de axônios, são melhor estudadas com técnicas que capturam eventos em tempo real com múltiplas observações de cada animal vivo. Nossa capacidade de acompanhar os neurônios em série in vivo aumentou dramaticamente devido a inovações revolucionárias em óptica e transgênicos mouse. Várias linhas de camundongos transgênicos thy1-GFP, na qual subconjuntos de neurônios são geneticamente distintos rotulados em cores fluorescentes, permitem que os neurônios individuais a ser trabalhada in vivo 1. Esses camundongos têm sido amplamente utilizadas para in vivo de imagens de músculo 2-4 e 5-7 cérebro, e forneceram introspecções novas nos mecanismos fisiológicos que análises estáticas não poderia ter resolvido. Estudos de imagem de neurônios da medula espinhal em viver só recentemente começaram. Lichtman e seus colegas demonstraram a sua viabilidade através do rastreamento feridos coluna dorsal (DC) com axônios de grande campo de microscopia de 8,9. Multi-fotão in vivo de imagens de axônios profundamente posicionado DC, microglia e os vasos sanguíneos também tem sido realizados 10. Ao longo dos últimos anos, somos pioneiros na aplicação de imagem in vivo para monitorar a regeneração de axônios DR usando gama microscopia de campo e linha de H thy1-YFP camundongos. Esses estudos nos levaram a uma nova hipótese sobre por que os axônios DR são impedidos de regeneração dentro da medula espinhal 11.
H em linha de thy1-YFP ratos, distinto axônios YFP + são superficialmente posicionado, o que permite que vários axônios ser monitorados simultaneamente. Aprendemos que os axônios DR chegar a DREZ são melhores visualizados na lombar do que na medula espinhal cervical. No presente relatório, nós descrevemos várias estratégias que temos encontrado útil para garantir a imagem de longo prazo e repetiu sucesso dos axônios em regeneração DR. Estes incluem métodos que eliminam intubação repetidas e interrupção respiratória, minimizar a cirurgia associada à tensão e formação de cicatrizes, e adquirir imagens estáveis em alta resolução sem fototoxicidade.
Protocol
Discussion
DR regeneração imagem diretamente em ratos vivos é particularmente desafiador, porque exige uma laminectomia dorsal substancial para monitorar o crescimento do axônio em uma ampla área seguido por vários procedimentos cirúrgicos invasivos e anestésico em sessões de imagem subseqüentes. Várias estratégias ajudaram a superar esses desafios. De imagem, primeiro sucesso requerida a redução da mortalidade mouse (aproximadamente 25%), minimizando a duração da anestesia e sangramento, e pelo cuidado pós-operat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Alan Tessler para comentários e ajudar a editorial. Este trabalho foi financiado pelo NIH NS062320.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wound clips | Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Riferimenti
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
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- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
