Receptor de imagem proteína G-Coupled (GPCR) mediada por eventos de sinalização que Quimiotaxia de Controle de Dictyostelium discoideum</em
Summary
Aqui, descrevemos os métodos detalhados de células vivas de imagem para investigar quimiotaxia. Apresentamos fluorescência métodos microscópicos para monitorar a dinâmica espaço-temporal dos eventos de sinalização em células migratórias. Medição dos eventos de sinalização nos permite entender melhor como uma rede de sinalização GPCR-alcança gradiente de detecção de quimioatrativos e controles de migração direcional das células eucarióticas.
Abstract
Muitas células eucarióticas pode detectar gradientes de sinais químicos em seus ambientes e migrar de acordo 1. Esta migração celular guiada é referido como quimiotaxia, que é essencial para várias células para realizar suas funções, tais como tráfico de células do sistema imunológico e padronização de células neuronais 2, 3. A grande família de G receptores acoplados à proteína (GPCRs) detecta variável pequenos peptídeos, conhecido como quimiocinas, para dirigir a migração celular in vivo 4. O objetivo final da quimiotaxia pesquisa é compreender como um sentidos máquinas GPCR quimiocina gradientes e controles de sinalização eventos que levam a quimiotaxia. Para este fim, usamos técnicas de imagem para monitorar, em tempo real, as concentrações de espaço-temporal de quimioatrativos movimento celular, em um gradiente de chemoattractant, GPCR mediada ativação da proteína G-heterotrimeric, e eventos de sinalização intracelular envolvidas na quimiotaxia de células eucarióticas 08/05 . O organismo simples eucarióticas, Dictyostelium discoideum, exibe comportamentos quimiotático que são semelhantes aos de leucócitos, e D. discoideum é um sistema modelo para estudar a quimiotaxia chave eucarióticas. Como amebas de vida livre, D. discoideum células dividem-se em meio rico. Após a fome, as células entrar em um programa de desenvolvimento em que agregada através AMPc mediada por quimiotaxia para formar estruturas multicullular. Muitos componentes envolvidos na quimiotaxia ao AMPc foram identificados em D. discoideum. A ligação de AMPc a um GPCR (car1) induz a dissociação da heterotrimeric G-proteínas em Gγ e subunidades Gβγ 7, 9, 10. Subunidades Gβγ ativar Ras, que por sua vez ativa PI3K, convertendo PIP PIP 2 em 3 na membrana celular 11-13. PIP 3 servem como sítios de ligação para proteínas com pleckstrin Homologia (PH) domínios, assim, o recrutamento dessas proteínas para a membrana 14, 15. Ativação de receptores car1 também controla as associações de membrana de PTEN, que desfosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. Os mecanismos moleculares são evolutivamente conservada em quimiotaxia quimiocina GPCR mediada das células humanas, tais como neutrófilos 18. Nós apresentamos métodos a seguir para estudar a quimiotaxia de D. células discoideum. 1. Preparação de células componentes quimiotáticos. 2. Quimiotaxia de imagem de células em um gradiente de cAMP. 3. Monitoramento de uma ativação induzida de GPCR heterotrimeric proteína G-in único de células vivas. 4. Imagem PIP chemoattractant dinâmica desencadeada três respostas em um único células vivas em tempo real. Nossos métodos de imagem desenvolvida pode ser aplicada para estudar a quimiotaxia de leucócitos humanos.
Protocol
Discussion
Os processos de atingir estágio competente quimiotáticos de células
Para o tipo selvagem D. células discoideum, leva cerca de 5 ~ 6 horas pulsando desenvolvimento à temperatura ambiente para induzi-los em um estágio bem quimiotáticos competente durante o qual células apresentam uma morfologia bem polarizada celular e migração celular rápida (Fig. 1). Vários fatores, tais como a concentração de cAMP pulsação, temperatura e diferentes origens genéticas, podem af…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo fundo intramural do NIAID, NIH.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes | ||
| cAMP | Sigma | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Zeiss | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
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