Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
Summary
Eine Methode zur Abschätzung der Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand (<em> K<sub> B</sub</em>) Ein G-Protein-gekoppelten Rezeptor beschrieben. Die Analyse bietet absolute oder relative Maßnahmen<em> K<sub> B</sub</em> Je nachdem, ob konstitutive Rezeptoraktivierung messbar ist. Unsere Methode bezieht sich auf verschiedene Reaktionen unterhalb von Rezeptor-Aktivierung.
Abstract
Wenn ein Agonist eine Bevölkerung von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) aktiviert, löst es einen Signalweg, der in der Reaktion der Zelle oder eines Gewebes gipfelt. Dieser Prozess kann auf der Ebene eines einzelnen Rezeptors, eine Bevölkerung von Rezeptoren oder einer nachgeschalteten Reaktion analysiert werden. Hier beschreiben wir, wie die nachgeschaltete Reaktion zu analysieren, um eine Schätzung des Agonisten Affinitätskonstante für den aktiven Zustand einzelner Rezeptoren zu erhalten.
Rezeptoren verhalten, als quantal Switches, die abwechselnd zwischen aktiven und inaktiven Zuständen (Abbildung 1). Der aktive Zustand interagiert mit spezifischen G-Proteine oder andere Signalisierung Partnern. In Abwesenheit von Liganden, überwiegt in den inaktiven Zustand. Die Bindung von Agonisten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass der Rezeptor wird in den aktiven Zustand wechseln, weil ihre Affinitätskonstante für den aktiven Zustand (K b) ist viel größer als bei den inaktiven Zustand (K a). Die Summe derrandom Ausgänge aller der Rezeptoren in der Bevölkerung führt zu einem konstanten Niveau von Rezeptor-Aktivierung in der Zeit. Der Kehrwert der Konzentration des Agonisten entlocken halbmaximale-Rezeptor-Aktivierung ist äquivalent zu der beobachteten Affinitätskonstante (K obs), und der Anteil der Agonist-Rezeptor-Komplexe in den aktiven Zustand wird als Wirkungsgrad (ε) (Abbildung 2) definiert.
Methoden zur Analyse der nachgeschalteten Reaktionen der GPCRs sind entwickelt worden, damit die Schätzung der K obs und relative Wirksamkeit eines Agonisten 1,2. In diesem Bericht zeigen wir, wie diese Analyse zu modifizieren, um den Agonisten K b-Wert relativ zu dem eines anderen Agonisten zu schätzen. Für Tests, die konstitutive Aktivität aufweisen, zeigen wir, wie K b in absoluten Einheiten von M -1 abschätzen.
Unsere Methode zur Analyse von Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven 3,4 bestehtder globalen nichtlineare Regression mit dem operativen Modell 5. Wir beschreiben ein Verfahren, mit dem Software-Anwendung, Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Die Analyse liefert eine Schätzung des Produktes der K obs und ein Parameter proportional zur Wirksamkeit (τ). Die Schätzung der τK obs eines Agonisten, durch die eines anderen geteilt wird, ist ein relatives Maß für K b (RA i) 6. Für jeden Rezeptor aufweisen konstitutiven Aktivität ist es möglich, einen Parameter proportional zur Wirksamkeit des freien Rezeptor-Komplex (τ sys) zu schätzen. In diesem Fall wird die K b-Wert eines Agonisten entspricht τK obs / τ SYS 3.
Unsere Methode ist nützlich für die Bestimmung der Selektivität der Agonist für Rezeptor-Subtypen und zur Quantifizierung der Agonist-Rezeptor-Signalwege durch verschiedene G-Proteine.
Protocol
Discussion
Da unsere Methode zur Schätzung der RA i (relative K b-Wert) erfordert nur die Messung des Agonisten Konzentrations-Wirkungs-Kurven, kann unsere Analyse auch jederzeit diese Kurven gemessen werden.
Wenn der Tag zu Tag Variation in der Reaktion des experimentellen Vorbereitung (zB Zellen oder Gewebe) groß ist, kann die Antwort Messungen der einzelnen Konzentrations-Wirkungs-Kurve relativ zu den "Top" Schätzung der Standardabweichung Agonist…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grants GM 69829 unterstützt.
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