Het uitvoeren van op maat MicroRNA microarray experimenten

Summary

Een eenvoudige procedure van het uitvoeren van op maat microRNA microarray experimenten beschreven. De stappen omvatten het isoleren van RNA, etikettering RNA en DNA, het hybridiseren van het monsters microarrays, het scannen van de microarrays, kwantificeren en analyseren van hybridisatie signalen.

Abstract

microRNAs (miRNAs) zijn een grote familie van ~ 22 nucleotiden (nt) lange RNA-moleculen die op grote schaal worden uitgedrukt in ^een eukaryoten. Complex genomen coderen minstens honderden miRNAs, die vooral remmen de expressie van een groot aantal van target genen post-transcriptioneel ^{2, 3.} miRNAs controle een breed scala van biologische processen ^1. Daarnaast heeft veranderd miRNA expressie in verband gebracht met menselijke ziekten zoals kanker, en miRNAs kunnen dienen als biomarkers voor ziekten en prognose ^{4, 5.} Het is daarom belangrijk te begrijpen van de expressie en functies van miRNAs onder diverse omstandigheden.

Drie belangrijke benaderingen zijn gebruikt om het profiel van miRNA expressie: real-time PCR, microarray, en diepe sequencing. De techniek van miRNA microarray heeft het voordeel dat high-throughput, over het algemeen minder duur, en de meeste van de experimentele en de analyse stappen kunnen worden carrIED in een moleculaire biologie laboratorium bij de meeste universiteiten, medische faculteiten en de bijbehorende ziekenhuizen. Hier beschrijven we een methode voor het uitvoeren van op maat miRNA microarray experimenten. Een miRNA probe set zal worden afgedrukt op glas dia's miRNA microarrays te produceren. RNA is geïsoleerd met behulp van een methode of reagens dat kleine RNA-soorten jam, en vervolgens voorzien van een fluorescentie kleurstof. Als een controle, zijn DNA-oligonucleotiden die overeenkomen met een subset van miRNAs ook gelabeld met een andere fluorescentie kleurstof. De referentie-DNA zal dienen om de kwaliteit van de dia-en hybridisatie aan te tonen en zal ook gebruikt worden voor data normalisatie. Het RNA en DNA zijn gemengd en gehybridiseerd aan een microarray slide met probes voor het grootste deel van de miRNAs in de database. Na het wassen is de dia gescand om beelden te verkrijgen, en intensiteiten van de individuele plekken gekwantificeerd. Deze ruwe signalen zullen verder worden verwerkt en geanalyseerd als de expressie data van de overeenkomstige miRNAs. Microarray dia's kunnen worden gestript en geregenereerd om de kosten van microarrays te verminderen en de consistentie van microarray experimenten te verbeteren. Dezelfde principes en procedures zijn van toepassing op andere vormen van custom microarray experimenten.

Protocol

1. Afdrukken van aangepaste miRNA microarrays Druk de microarray dia's met behulp van de microarray kern van facilitaire diensten aan een universiteit of een bedrijf. De kwaliteit van de microarray fabricage is een van de meest kritische factoren voor het succes van een microarray experiment. Probeer een paar diensten, indien mogelijk. Idealiter zou een afdruk 50-100 dia's in een tijd, en alle dia's eruit zal zien identiek, met goed gescheiden, individuele plekken. Voor microarray-onders…

Discussion

Ondanks de recente ontwikkelingen in de diepe sequencing technologie, micro-array nog steeds een levensvatbare keuze voor high-throughput analyse van DNA en RNA. In vergelijking met diepe sequencing, microarray experimenten zijn goedkoper, en een typische moleculaire biologie laboratorium kan de meeste van de experimenten en data-analyse in huis, die zorgt voor flexibiliteit en bespaart tijd. In de toekomst, microarrays zijn waarschijnlijk zeer geschikt om intensief te ondervragen sets van genen, bijvoorbeeld, kan alle …

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent