A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA
Summary
Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.
Abstract
microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos 1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente 2, 3. miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos 1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico 4, 5. É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições.
Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.
Protocol
Discussion
Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi suportado em parte pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas Center (P50 DA 011.806) e Exército dos Estados Unidos Departamento de Defesa (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
Riferimenti
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