Udførelse Brugerdefineret MicroRNA Microarray Eksperimenter
Summary
En simpel procedure til at udføre brugerdefinerede microRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinene omfatter isolere RNA, mærkning RNA og reference DNA, hybridizing prøverne til microarrays, scanning af microarrays, kvantificere og analysere hybridisering signaler.
Abstract
microRNA (miRNA) er en stor familie af ~ 22 nukleotider (NT) lange RNA molekyler, der er bredt udtrykt i eukaryoter 1. Komplekse genomer indkode mindst hundredvis af miRNA, der primært hæmmer udtryk for et stort antal af mål gener efter transcriptionally 2, 3. miRNA styre en bred vifte af biologiske processer 1. Hertil kommer, har ændret miRNA udtryk været forbundet med menneskelige sygdomme såsom kræft, og miRNA kan tjene som biomarkører for sygdomme og prognose 4, 5. Det er derfor vigtigt, at forstå udtryk og funktioner miRNA under mange forskellige forhold.
Tre store tilgange har været ansat for at profilere miRNA udtryk: real-time PCR, microarray og dybe sekventering. Teknikken af miRNA microarray har den fordel, at high-throughput, generelt billigere, og de fleste af de eksperimentelle og analyse trin kan CarrIED i et molekylærbiologisk laboratorium på de fleste universiteter, medicinske skoler og tilknyttede hospitaler. Her beskriver vi en metode til at udføre brugerdefinerede miRNA microarray eksperimenter. En miRNA probe sæt vil blive trykt på objektglas til at producere miRNA microarrays. RNA er isoleret ved hjælp af en metode eller reagens, der bevarer små RNA arter, og derefter mærket med et fluorescerende farvestof. Som en kontrol, der henvises DNA oligonukleotider svarende til en delmængde af miRNA også mærket med en anden fluorescens farvestof. Henvisningen DNA vil tjene til at demonstrere kvaliteten af dias og hybridisering, og vil også blive brugt til data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridiseret til en microarray slide indeholdende prober for de fleste af miRNA i databasen. Efter vask er det dias scannes for at få billeder og intensiteten af de enkelte pletter kvantificeret. Disse rå signaler vil blive yderligere behandlet og analyseret som et udtryk data i de tilsvarende miRNA. Microarray slides kan fjernes, og regenereres til at reducere omkostningerne ved microarrays og styrke sammenhængen i microarray eksperimenter. De samme principper og procedurer, som gælder for andre typer af brugerdefinerede microarray eksperimenter.
Protocol
Discussion
Trods nylige fremskridt i dyb sekventering teknologier, forbliver microarray en levedygtig valg for high-throughput analyse af DNA og RNA. Sammenlignet med dyb sekventering, microarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologisk laboratorium kan udføre de fleste af de eksperimenter og dataanalyse in-house, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden er microarrays sandsynligvis velegnet til intensivt afhøre sæt af gener, fx kan alle eller en delmængde af de transkriptionsfakt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet delvist af National Institute of Drug Abuse Center (P50 DA 011.806) og United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
Riferimenti
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
