Exécution personnalisée expériences de micropuces MicroRNA

Summary

Une procédure simple d'effectuer des expériences de micropuces personnalisées microARN est décrite. Les étapes comprennent isoler l'ARN, l'étiquetage ARN et l'ADN de référence, l'hybridation des échantillons à puces, la numérisation des microarrays, quantifier et analyser les signaux d'hybridation.

Abstract

microARN (miARN) sont une grande famille de ~ 22 nucléotides (nt) de longues molécules d'ARN qui sont largement exprimés dans les eucaryotes ^1. Génomes complexes codent pour au moins plusieurs centaines de miARN, qui sont principalement inhiber l'expression d'un grand nombre de gènes cibles de post-transcriptionnel ^{2, 3.} miARN contrôler un large éventail de processus biologiques ^1. En outre, l'expression du miARN modifié a été associée à des maladies humaines telles que les cancers, et miARN peuvent servir de biomarqueurs pour les maladies et le pronostic ^{4, 5.} Il est donc important de comprendre l'expression et les fonctions des miARN dans diverses conditions.

Trois grandes approches ont été employées pour l'expression du miARN profil: PCR en temps réel, puces à ADN et le séquençage en profondeur. La technique des biopuces miARN a l'avantage d'être à haut débit, généralement moins coûteux, et la plupart des étapes expérimentales et l'analyse peuvent être CarrIED dans un laboratoire de biologie moléculaire à la plupart des universités, écoles de médecine et des hôpitaux associés. Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer des expériences de micropuces personnalisées miARN. Un ensemble de sondes miARN seront imprimés sur des lames de verre pour produire des puces miARN. L'ARN est isolé en utilisant une méthode ou d'un réactif qui préserve les espèces de petits ARN, puis marquées avec un colorant fluorescent. Comme contrôle, oligonucléotides d'ADN de référence correspondant à un sous-ensemble des miARN sont également marqués par un colorant différent de fluorescence. L'ADN de référence servira à démontrer la qualité de la lame et l'hybridation et sera également utilisé pour la normalisation des données. L'ARN et l'ADN sont mélangés et hybridés sur une lame de biopuces contenant des sondes pour la plupart des miARN dans la base de données. Après le lavage, la lame est scanné afin d'obtenir des images et des intensités des spots individuels quantifiés. Ces signaux bruts seront encore traitées et analysées que les données d'expression de l'miARN correspondants. MicroAdiapositives rray peut être dépouillé et régénérée pour réduire le coût des puces à ADN et à renforcer la cohérence des expériences sur biopuces. Les mêmes principes et les procédures sont applicables à d'autres types d'expériences de micropuces personnalisées.

Protocol

1. Impression de puces personnalisées miARN Imprimer la puce diapositives en utilisant les services biopuces installation de base à une université ou une entreprise. La qualité de fabrication de puces à ADN est l'un des facteurs les plus critiques pour le succès d'une expérience microarray. Essayez un peu de services si possible. Idéalement, il faudrait imprimer de 50 à 100 lames à la fois, et toutes les diapositives sera identique, avec bien séparés, les taches individuelles. Po…

Discussion

Malgré les progrès récents dans les technologies de séquençage profond, biopuces reste un choix viable pour analyse à haut débit de l'ADN et l'ARN. Comparé à un séquençage en profondeur, les expériences biopuces sont moins chers, et un laboratoire de biologie moléculaire typique peut exécuter la plupart des expériences et l'analyse des données en interne, ce qui permet une flexibilité et un gain de temps. Dans l'avenir, les puces sont susceptibles bien adapté à interroger de manière i…

Materials

Items	Vendor	Catalogue number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo/Erie Scientific	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent