Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme
Summary
Özel microRNA mikroarray deneyler basit bir prosedür açıklanmıştır. Adımlar, RNA, etiketleme RNA ve referans DNA izole mikroarray'ler için örnekleri literatürde, mikroarray'ler tarama ve niceleme hibridizasyon sinyalleri analiz içerir.
Abstract
microRNA (miRNA'lar), yaygın olarak ökaryotlarda 1 olarak ifade edilir ~ 22 nükleotidler (nt) uzun RNA molekülleri büyük bir aileyiz . Kompleks genomların öncelikle bir çok sayıda post-transkripsiyonel hedef genlerin 2, 3 ekspresyonunu inhibe kullarak en az yüzlerce kodlayın. miRNA'lar biyolojik süreçlerin 1 geniş bir kontrol eder. Buna ek olarak, değişen miRNA ifadesi, bu tür kanserleri gibi insan hastalıkları ile ilişkili olduğu ve miRNA'lar hastalıkları ve prognozu 4, 5 biyobelirteçleri olarak hizmet edebilir. Bu nedenle, ifade ve pek çok farklı koşullar altında miRNA'lar fonksiyonları anlamak önemlidir.
Real-time PCR, mikroarray ve derin sıralama: Üç büyük yaklaşımlar profil miRNA ifade istihdam edilmiştir. MiRNA mikroarray tekniği yüksek verimli olma avantajı, genellikle daha az pahalı, deney ve analiz adımları carr olabilirüniversiteler, tıp fakülteleri ve ilişkili hastaneler, bir moleküler biyoloji laboratuvarı ied. Burada, özel miRNA mikroarray deneyler için bir yöntem açıklanmaktadır. MiRNA miRNA mikroarray'ler prob seti üretmek için cam slaytlar basılacaktır. RNA küçük RNA türleri koruyan bir yöntem ya da reaktif kullanılarak izole edilmiş, ve ardından floresan bir boya ile etiketlenmiş. Kontrol olarak, miRNA'lar bir alt kümesi karşılık gelen referans DNA oligonükleotidler de farklı bir floresan boya ile işaretlenmiştir. Referans DNA slayt ve melezleşme kalitesini göstermek için hizmet verecek ve aynı zamanda veri normalleşmesi için kullanılacaktır. RNA ve DNA karışık ve veritabanı miRNA'lar en problar içeren bir mikroarray slayt melezleşmiştir. Yıkadıktan sonra, slayt görüntüler elde etmek için taranmış ve şiddetleri sayısal tek tek noktalar. Bu ham sinyalleri, ileri işlenmiş ve ilgili miRNA'lar ifade veri olarak analiz edilecektir. Microarray slaytlar microarrays maliyetini azaltmak ve tutarlılık mikroarray deneyler geliştirmek için elimden ve rejenere olabilir. Aynı usul ve esaslar özel mikroarray deneylerin diğer türleri için geçerlidir.
Protocol
Discussion
Mikroarray derin sıralama teknolojilerindeki son gelişmelere rağmen, DNA ve RNA yüksek verimlilik analizi için uygun bir seçenek kalır. Derin bir sıralama ile karşılaştırıldığında, mikroarray deneyler ucuzdur ve tipik bir moleküler biyoloji laboratuvarı deney ve esneklik sağlar ve zaman kazandırır veri analizi, in-house, en gerçekleştirebilirsiniz. Gelecekte, muhtemelen mikroarray'ler uygundur genler, örneğin setleri yoğun sorgulamak için, bir genom veya miRNA'lar transkripsiyon faktö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Uyuşturucu Merkezi Ulusal Enstitüsü (P50 DA 011.806) ve Amerika Birleşik Devletleri Ordusu Milli Savunma Bakanlığı (W81XWH-07-1-0183) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Items | Vendor | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo/Erie Scientific | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent |
Riferimenti
- Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 431, 350-355 (2004).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. miRNAs in human cancer. J. Pathol. 223, 102-115 (2011).
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
