Visualização da função respiratória mitocondrial usando Citocromo C Desidrogenase Oxidase / Succinato (COX / SDH) Histoquímica rotulagem dupla
Summary
O citocromo c oxidase desidrogenase / sódio (COX / SDH) método duplo-rotulagem permite a visualização direta de deficiências enzimáticas mitocondriais respiratória em seções de tecido fresco congelado. Esta é uma técnica simples histoquímica e é útil na investigação de doenças mitocondriais, envelhecimento, envelhecimento e distúrbios relacionados.
Abstract
DNA mitocondrial (mtDNA) defeitos são uma importante causa de doença e pode ser a base de envelhecimento e relacionadas ao envelhecimento 1,2 alterações. A teoria mitocondrial do envelhecimento sugere um papel para mutações do mtDNA, que pode alterar a homeostase bioenergética e função celular, no processo de envelhecimento 3. A riqueza de evidências foram compiladas em apoio a este 1,4 teoria, a exemplo do mtDNA modificador do mouse 5, mas o papel preciso de mtDNA danos do envelhecimento não é totalmente compreendido 6,7.
Observando a atividade das enzimas respiratórias é uma abordagem simples para investigar a disfunção mitocondrial. Complexo IV ou citocromo c oxidase (COX), é essencial para a função mitocondrial. As subunidades catalítica da COX são codificadas por mtDNA e são essenciais para a montagem do complexo (Figura 1). Assim, a síntese adequada e função são em grande parte com base na integridade mtDNA 2.Apesar de outros complexos respiratórios poderiam ser investigados, Complexos IV e II são as mais passíveis de exame histoquímico 8,9. Complexo II ou succinato desidrogenase (SDH), é inteiramente codificada pelo DNA nuclear (Figura 1), e sua atividade normalmente não é afetado por deficiência mtDNA, apesar de um aumento pode indicar biogênese mitocondrial 10-12. O mtDNA prejudicada observado em doenças mitocondriais, envelhecimento e doenças relacionadas à idade, muitas vezes leva à presença de células com baixa ou ausente a atividade da COX 2,12-14. Embora as atividades de COX e SDH podem ser investigados individualmente, o método duplo-rotulagem seqüencial 15,16 provou ser vantajoso para localizar células com disfunção mitocondrial 12,17-21.
Muitas das constituições ótima do ensaio foram determinadas, como a concentração do substrato, receptores de elétrons / doadores, intermediário portadores de elétrons, a influência do pH e de reação time 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) é um doador de elétrons eficaz e confiável 22. Em células com funcionamento COX, o indamine marrom produto polímero irá localizar em cristas mitocondriais e saturar as células 22. Essas células com COX disfuncionais, portanto, não ser saturado pelo produto DAB, permitindo a visualização da atividade SDH pela redução da nitroblue tetrazólio (NBT), um receptor de elétrons, a um produto azul final formazan 9,24. Citocromo c e substratos succinato de sódio são adicionados para normalizar os níveis endógenos entre controle e doentes / mutante tecidos 9. Catalase é adicionado como uma precaução para evitar possíveis reações contaminação da atividade da peroxidase 9,22. Metasulfato fenazina (PMS), uma transportadora de elétrons intermediário, é utilizado em conjunto com azida de sódio, um inibidor da cadeia respiratória, para aumentar a formação dos produtos da reacção final de 9,25. Apesar desta informarção, alguns detalhes críticos que afetam o resultado deste ensaio seemly simples, além de controles especificidade e avanços na técnica, ainda não foram apresentados.
Protocol
Discussion
O método de COX / SDH combinado histoquímica permite a visualização de células com disfunção mitocondrial. Esta técnica, com estudos iniciais datam de 1968, permanece popular, com muitos considerando-o "padrão ouro" para a identificação de doenças mitocondriais em pacientes 14,19,26,27. Agora, é freqüentemente usada para investigar o envelhecimento mutação mtDNA-driven e envelhecimento distúrbios relacionados 12,13,18,20,21,24. A COX / SDH método duplo-rotulagem é frequ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional do Envelhecimento (AG04418), Instituto Nacional de Abuso de Drogas, Instituto Nacional do Programa de Saúde Karolinska Institutet Parcerias Pós-Graduação, Karolinska Institutet, da Suécia de Pesquisa do Conselho, Brain Power Sueco e Fundação Cérebro sueco. Muito obrigado a Mattias Karlen e Giuseppe Dr. Coppotelli de apoio criativo com a Figura 1 e 2, respectivamente; Karin Pernold de assistência técnica; e as Dras. Barry J. Hoffer, Lars Olson, e Nils-Göran Larsson para o conselho útil muito e discussão.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
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