Visualisatie van Mitochondriale respiratoire functie met behulp van cytochroom C Oxidase / succinaat dehydrogenase (COX / SDH) Double-labeling Histochemistry
Summary
Het cytochroom c oxidase / natrium dehydrogenase (COX / SDH) double-labeling methode maakt het mogelijk voor de directe visualisatie van mitochondriale ademhaling enzymdeficiënties in vers ingevroren weefsel secties. Dit is een eenvoudige techniek histochemische en is nuttig bij het onderzoek naar mitochondriële ziekten, veroudering, en veroudering-gerelateerde aandoeningen.
Abstract
Mitochondriaal DNA (mtDNA) defecten zijn een belangrijke oorzaak van de ziekte en kunnen ten grondslag liggen aan veroudering en veroudering gerelateerde veranderingen 1,2. De mitochondriale theorie van veroudering suggereert een rol voor mtDNA mutaties, die bio-energetica homeostase en cellulaire functie kan, veranderen in het verouderingsproces 3. Een schat aan bewijs is samengesteld ter ondersteuning van deze theorie 1,4, een voorbeeld hiervan is het mtDNA mutator muis 5, maar de precieze rol van mtDNA schade bij veroudering is het niet helemaal begrepen 6,7.
Het observeren van de activiteit van de respiratoire enzymen is een rechttoe rechtaan aanpak voor het onderzoeken van mitochondriale dysfunctie. Complex IV, of cytochroom c oxidase (COX), is essentieel voor mitochondriale functie. De katalytische subeenheden van COX worden gecodeerd door mtDNA en zijn essentieel voor de montage van het complex (figuur 1). Zo zijn een goede synthese en functie grotendeels gebaseerd op mtDNA integriteit 2.Hoewel andere respiratoire complexen kon worden onderzocht, complexen IV en II zijn het meest vatbaar voor histochemische onderzoeken 8,9. Complex II, of succinaat dehydrogenase (SDH), wordt volledig gecodeerd door nucleair DNA (figuur 1), en de activiteit is meestal niet beïnvloed door een verminderde mtDNA, maar een verhoging zou kunnen mitochondriale biogenese 10-12 aan te geven. De verminderde mtDNA waargenomen in mitochondriale ziekten, veroudering, en leeftijd gerelateerde ziekten leidt vaak tot de aanwezigheid van cellen met een lage of afwezige activiteit van COX 2,12-14. Hoewel de COX-en SDH-activiteiten kunnen individueel worden onderzocht, heeft de sequentiële dubbele labeling methode 15,16 bleek gunstig zijn in de plaatsbepaling van cellen met mitochondriale dysfunctie 12,17-21.
Veel van de optimale grondwetten van de test zijn bepaald, zoals de substraat concentratie, elektronen acceptoren / donateurs, tussentijdse elektronen dragers, invloed van pH, en de reactie time 9,22,23. 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) is een effectieve en betrouwbare elektron donor 22. In cellen met functioneren COX, zal de bruine indamine polymeer product te lokaliseren in het mitochondriaal cristae en verzadigen cellen 22. Die cellen met disfunctionele COX zal daarom niet worden verzadigd door de DAB-product, waardoor voor de visualisatie van de SDH-activiteit door vermindering van nitroblauw tetrazolium (NBT), een elektron acceptor, een blauwe formazanproduct eindproduct 9,24. Cytochroom c en natrium succinaat substraten worden toegevoegd aan endogene niveaus tussen controle en zieke / mutant weefsels 9 normaliseren. Catalase wordt toegevoegd als een voorzorgsmaatregel om mogelijke vervuilende reacties van peroxidase-activiteit 9,22 te vermijden. Fenazine methosulfaat (PMS), een tussentijdse elektron drager, wordt gebruikt in combinatie met natrium azide, een ademhalingsketen-remmer, tot de vorming van de uiteindelijke reactieproducten 9,25 te verhogen. Ondanks deze op de hoogteatie, enkele kritische details die het resultaat van deze betamelijk eenvoudige test, in aanvulling op specificiteit controles en de vooruitgang in de techniek, zijn nog niet gepresenteerd.
Protocol
Discussion
De gecombineerde COX / SDH histochemische methode kan de visualisatie van cellen met mitochondriale dysfunctie. Deze techniek, met vroege studies die teruggaat tot 1968, blijft populair, met vele overweegt het de "gouden standaard" voor het identificeren van mitochondriale ziekten bij patiënten 14,19,26,27. Het is nu vaak gebruikt om mtDNA mutatie-driven veroudering en veroudering-gerelateerde aandoeningen 12,13,18,20,21,24 te onderzoeken. De COX / SDH dubbel-labeling methode wordt vaak …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Aging (AG04418), National Institute on Drug Abuse, National Institute of Health-Karolinska Institutet Graduate Partnerships Program, Karolinska Institutet, Zweeds Research Council, de Zweedse Brain Power, en Zweeds Hersenstichting. Veel dank aan Mattias Karlen en dr. Giuseppe Coppotelli voor creatieve ondersteuning bij figuur 1 en 2, respectievelijk; Karin Pernold voor technische bijstand, en Drs. Barry J. Hoffer, Lars Olson, en Nils-Göran Larsson voor veel nuttige adviezen en discussie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dry Ice | AGA Gas AB | block form | |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma-Aldrich | 277258 CAS: 78-78-4 |
|
| Cyrostat embedding solution | Sakura Finetek | Tissue Tek 4583 | |
| Cryostat | Microm | Microm Model HM 500M | |
| Slides | Thermo Scientific | Super Frost Plus Menzel Gläser J1800AMWZ |
|
| Cover glasses Borosilicate glass |
VWR International | 16004-098 | 24 x 50 mm |
| Filter Paper | Munktell Filter AB | Quality: 1350 Article Number: 242 001 |
430 x 430 mm |
| 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | Sigma Liquid Substrate System, D7304 | |
| Cytochrome c (Type III, from equine heart) | Sigma-Aldrich | C2506 CAS: 9007-43-6 |
|
| Bovine catalase (from liver) | Sigma-Aldrich | C9322 CAS: 9001-05-2 |
|
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 CAS: 298-83-9 |
|
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 CAS: 6106-21-4 |
|
| Phenazine methosulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 CAS: 299-11-6 |
PMS is light sensitive. Shield from light. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 CAS: 26628-22-8 |
|
| Xylene | VWR International | EM-XX0060-4 | |
| Entellan | VWR International | 100503-870 | |
| Malonate (Malonic acid) |
Sigma-Aldrich | M1296 CAS: 141-82-2 |
Riferimenti
- Larsson, N. G. Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging. Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).
- Cottrell, D. A. Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).
- Harman, D. The biologic clock: the mitochondria. J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).
- Wallace, D. C. Mitochondrial genetics – a paradigm for aging and degenerative diseases. Science. 256, 628-632 (1992).
- Trifunovic, A. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 429, 417-423 (2004).
- Ameur, A. Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins. PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).
- Safdar, A. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).
- DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. Mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).
- Old, S. L., Johnson, M. A. Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle. Histochem. J. 21, 545-555 (1989).
- Chaturvedi, R. K. Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington’s disease. Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).
- Edgar, D. Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice. Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).
- Ross, J. M. High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).
- Crugnola, V. Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis. Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).
- Nonaka, I. Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency. Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).
- DiMauro, S. Mitochondrial encephalomyopathies. Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).
- Bonilla, E. New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies. Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).
- Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle. Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).
- Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death. Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).
- Gellerich, F. N. Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size. Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).
- Larsson, N. G. Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice. Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).
- Ekstrand, M. I. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).
- Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB). J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).
- Dubowitz, V., Brooke, M. Muscle Biopsy: A Modern Approach. , (1973).
- Cottrell, D. A. Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age. Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).
- Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres. Histochem. J. 20, 230-243 (1988).
- Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle. Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).
- Petruzzella, V. Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243. Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).
- Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations. J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).
- Haas, R. H. The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease. Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).
